Calcium (Ca2+) imaging is a commonly utilized neuroscience technique for in vivo recording of neuronal activity. It involves the optical measurement of calcium concentration using genetically encoded calcium indicators (GECI) [1]. However, the kinetics of changes in the fluorescence of GECI are relatively slow and limited by the biophysics of the calcium binding [2]. In response to single action potentials (APs) in pyramidal neurons, most of the widely used GECI have a fluorescence half-life of approximately 100 ms [3]. As a result, GECI cannot provide complete information about the dynamics of neural ensembles. To address this issue, new variants of GECI, such as jGCaMP7 [3], and jGCaMP8 [4], have been developed, or genetically encoded voltage indicators (GEVI), such as JEDI-2P [5], have been utilized. However, the speed of GECI or GEVI is still lower than that of electrophysiological registration methods. Thus, we have designed a microelectrode that can be utilized with a gradient lens for in vivo calcium imaging with a miniscope.
The miniscope is a miniature microscope for single photon epifluorescence Ca2+ imaging, which enables recording of neuronal activity in freely moving laboratory animals, unlike the traditionally used two-photon imaging technique. The miniscope utilizes gradient-index (GRIN) lenses that are implanted directly into the brain of a laboratory animal, instead of a conventional lens. The gradient lens is a transparent cylinder with a diameter of 1.8 mm and a length of 3.8 mm. To facilitate electrophysiological recording, we developed a microelectrode that can be aligned with a GRIN lens.
The microelectrode is a three-layer structure consisting of: 1) a polyimide film, 2) conductive copper tracks deposited through thermoforming, and 3) a polyimide film with cutouts for pads. On one side of the microelectrode, there are 12 gold-plated conductive contacts for registering local field potentials, while on the other side, a similar number of conductive tracks are present for connecting to a connector that transmits data to the processing board. The flexible microelectrode is wrapped around a gradient lens and fixed using thermoforming, after which it is implanted in the animal's brain.
Using the developed microelectrode, our aim is to perform a comparative analysis of the calcium and electrophysiological activity of hippocampal neurons in freely moving wild-type mice and in a mouse model of Alzheimer's disease. This study will enable the identification of any abnormalities in Alzheimer's disease at the level of neural ensembles and may suggest new treatment approaches or mechanisms for the development of the progressive memory loss pathology associated with this disease. We would like to express our gratitude to Anastasia Viktorovna Bolshakova for her administrative assistance, and to the staff of the Laboratory of Molecular Neurodegeneration for their invaluable help and advices.
Визуализация кальция (Ca2+) является широко используемым методом в нейробиологии для прижизненной регистрации нейронной активности. Она представляет собой оптическое измерение концентрации кальция с помощью генетически кодируемых кальциевых индикаторов (ГеККИ) [1]. Однако кинетика изменения флуоресценции ГеККИ относительно медленная и ограничена биофизикой связывания индикатора с кальцием [2]. В ответ на одиночные потенциалы действия (ПД) в пирамидальных нейронах большинство широко используемых ГеККИ имеют период полураспада флуоресценции порядка 100 мс [3]. Следовательно, ГеККИ не могут представить полную информацию о динамике нейронных ансамблей. Частично проблема решается путем создания новых вариантов ГеККИ, таких как jGCaMP7 [3], jGCaMP8 [4] или использованием генетически кодируемых индикаторов напряжения (ГеКИН) таких как JEDI-2P [5]. Однако скорость ГеККИ или ГеКИН все еще уступает скорости регистрации электрофизиологических методов. По этой причине мы разработали микроэлектрод, который можно использовать вместе с градиентной линзой для прижизненной кальциевой визуализации посредством минископа.
Минископ представляет собой однофотонный эпифлуоресцентный миниатюрный микроскоп для кальциевой визуализации. В отличие от традиционно применяемой двухфотонной визуализации, минископ позволяет регистрировать нейронную активность у свободно передвигающихся лабораторных животных. Вместо объектива у минископа используется линзы с градиентным показателем преломления (GRIN линзы), которые имплантируется непосредственно в мозг лабораторного животного. Градиентные линзы представляющую собой прозрачный цилиндр диаметром 1.8 мм и длиной 3.8 мм. Для реализации электрофизиологической записи мы разработали микроэлектрод, который можно совместить в GRIN линзой.
Микроэлектрод представляет собой трехслойную структуру: 1 – полиимидная пленка, 2 – токопроводящие медные дорожки, нанесенных методом термоформовки, 3 – полиимидная пленка с вырезами для контактных площадок. На одной из сторон микроэлектрода расположены 12 позолоченных токопроводящих контактов для регистрации локальных полевых потенциалов, а на другой стороне аналогичное количество токопроводящих дорожек для подключения коннектора, осуществляющего передачу данных на плату обработки. Гибкий микроэлектрод оборачивается вокруг градиентной линзы с фиксацией путем термоформовки и впоследствии имплантируется в головной мозг животного.
С помощью разработанного микроэлектрода мы планируем провести сравнительный анализ кальциевой и электрофизиологической активности нейронов гиппокампа свободно передвигающихся мышей дикого типа и с моделью болезни Альцгеймера. Данное исследование позволит выявить нарушения при болезни Альцгеймера на уровне нейронных ансамблей и как следствие предположить потенциально новые методы лечения или механизмы развития патологии, связанной с прогрессирующей потерей памяти при болезни Альцгеймера. Мы благодарны Большаковой Анастасии Викторовне за административную помощь, а также сотрудникам Лаборатории молекулярной нейродегенерации за помощь и полезные советы.