Though the principles of central nervous system development are genetically encoded, the cortical activity is also critically involved in these processes. While this question is quite important, up to now we are limited in our understanding of the role that neuronal activity plays in formation of functionally linked cellular ensembles in the developing cortex. Recently, transient inhibitory neuronal projections were shown in the barrel cortex during the critical period of its development. Expression of interneuronal connections from infragranular to other cortical layers exactly during the period of barrel formation suggests their critical role in establishment of adult-like columnar organization of the barrel cortex. While the inhibitory connections were demonstrated, the question remains, whether the transient connectivity is restricted by emergence of inhibitory projections, or both types (including excitatory connections) could be expressed during the critical period of the barrel cortex development.
Here, we aimed to answer this question using in vitro optogenetic stimulation of the neurons in the infragranular layers of the neonatal mouse barrel cortex. A viral vector of serotype AAV.PHP.eB containing channelrhodopsin-2 along with a fluorescent Venus tag sequence under the hSyn promoter was delivered via intraventricular injection into the neonatal mouse brain at P0. This transduction protocol resulted in neuron-specific expression of the construct primarily in the L2/3, L5 and L6 cortical layers at P7. At P7, acute coronal brain slices containing the barrel cortical field were prepared. For a given cortical column, the infragranular layers were optogenetically mapped while simultaneous whole-cell electrophysiological registration of a pyramidal cell in the barrel was performed. Holding potential was varied to discriminate between light-evoked EPSCs and IPSCs.
The results of our preliminary recordings in the neonatal somatosensory cortex showed presence of neuronal projections from infra- to granular layer, which is in agreement with the already demonstrated data. However, L4 EPSCs evoked by infragranular layer stimulation were also recorded, suggesting the expression of the excitatory connections from infra- to granular layers early in development. Though we require to continue our recordings, our findings suggest an even more complex network interactions that shape the barrel cortex L4 during the early postnatal stages.
Несмотря на то, что принципы развития центральной нервной системы предопределены генетически, нейронная активность коры при этом также критически необходима. Хотя этот вопрос является достаточно важным, на данный момент наше понимание той роли, которую нейронная активность играет в формировании функционально связанных ансамблей в развивающейся коре, довольно ограничено. Недавно было показано, что в соматосенсорной баррельной коре во время критического периода ее развития существуют транзиентные тормозные нейронные проекции. Наличие связей между нейронами инфрагранулярного и других слоев именно в период формирования баррелей говорит о критически важной роли этих связей в формировании зрелой колонковой организации баррельной коры. Несмотря на то, что найдены тормозные связи, остается вопрос, исчерпывается ли этим транзиентная коннективность в критический период развития баррельной коры, или же на этом этапе присутствуют оба типа (как тормозные, так и возбуждающие связи).
В данной работе мы попытались ответить на этот вопрос с помощью метода оптогенетической стимуляции нейронов инфрагранулярных слоев соматосенсорной баррельной коры неонатальных мышей in vitro. Вирусный вектор серотипа AAV.PHP.eB, содержащий последовательность канального родопсина-2, а также флуоресцентной метки Venus под человеческим синапсиновым промотором hSyn, вводился в мозг мыши методом церебрально-желудочковой инъекции на нулевой постнатальный день. Такой протокол трансдукции обеспечивал экспрессию конструкции в нейронах коры преимущественно 2/3, 5 и 6 слоев на седьмой постнатальный день. На седьмой постнатальный день были приготовлены переживающие корональные срезы мозга, содержащие баррельную кору. В рамках одной кортикальной колонки производилась оптогенетическая картирующая стимуляция инфрагранулярных слоев при одновременной электрофизиологической регистрации пирамидных нейронов в гранулярном слое. Нейроны регистрировались методом пэтч-кламп в конфигурации «целая клетка». Фиксируемый потенциал варьировался для того, чтобы различать между собой возбуждающие и тормозные постсинаптические токи.
Результаты наших предварительных экспериментов в неонатальной соматосенсорной коре свидетельствуют о наличии нейрональных проекций из инфрагранулярных слоев в гранулярный слой, что согласуется с уже известными данными. Однако в четвертом слое коры нами были зарегистрированы не только тормозные, но и возбуждающие постсинаптические токи, вызванные стимуляцией инфрагранулярных слоев, что позволяет сделать предположение о наличии возбуждающих связей между инфрагранулярными и гранулярным слоями на ранних этапах постнатального развития. Хотя необходимо проведение дальнейших экспериментов с регистрацией, наши результаты дают основания говорить о существовании еще более сложных, чем предполагалось ранее, сетевых взаимодействий, которые формируют облик четвертого слоя баррельной коры на ранних постнатальных стадиях развития.