Long-term experience was gained in analyzing synapses and their glial surroundings in normal, natural, and experimental models of functional plasticity and brain pathology development. However, most studies in this area rely on electrophysiological techniques combined with fluorescent imaging. Notably, fine synapse structure and astrocytic processes cannot be resolved using light or some electron microscopy techniques. Studies on experimental brain pathology using volume electron microscopy methods [1] were previously restricted due to their high labor intensity. However, automated methods for sample preparation and analysis, using machine vision and artificial intelligence, significantly simplified this task.
Using transmission electron microscopy methods and 3D reconstructions, this study examined the Str. radiatum CA1 hippocampal region of rat brains in a chronic lithium-pilocarpine model of epilepsy. The results indicate a decrease in synaptic number along with an increase in their size and a reduction in astrocytic isolation of the active zones. A decrease in glial ensheathment of enlarged active zones and facilitation of neurotransmitter diffusion to active synapses may have a multiplicative effect on epileptiform activity growth and excitotoxicity.
The simplification of the astrocytes meshwork in the somatosensory cortex’s layer 2/3 is comparable to that of layer 1. This decrease in layer 1’s inhibitory action enables pyramidal neurons in layer 2/3 to potentially exhibit epileptiform activity. Thus, the superficial cortical layers’ structural-functional aspects can be used as a natural cellular model in epilepsy development studies.
Reduction of Ca2+ events in astrocyte processes in lithium-pilocarpine induced epilepsy may result from the low buffer capacity of Ca2+ ions in the smooth endoplasmic reticulum (sER) and/or impaired Ca2+ wave transmission through the gap junctions between astrocytic processes. High resolution is necessary to analyze the gap junctions, and special methods are required for sER visualization in perisynaptic astrocytic processes.
We developed original sER staining methods [2] to quantitatively evaluate gap junctions and sER cisternae within astrocytic meshworks in layers 1 and 2/3 of the somatosensory cortex. In layer 1, the area of gap junctions in relation to the volume of an astrocyte was twice as high as in layer 2/3. The proportion of sER volume differed between layer 1 and layer 2/3 tissues. Specifically, the total sER cisternae volume in layer 2/3 was twice as high as in layer 1, relative to the volume of astrocytic processes [3]. Additionally, a doubling of single astrocytic gap junction area concomitant with decreased calcium events was observed.
The results suggest a normal balance between Ca2+ stores (sER) and gap junctions, whose disruption may contribute to the development of seizures.
Наработан многолетний опыт анализа синапсов и их глиального окружения в норме, в природных и экспериментальных моделях функциональной пластичности и развития патологии мозга. Однако большинство таких работ проводят электрофизиологическими методами в сочетании с флуоресцентным имиджингом, тогда как тонкая структура синапсов и окружающих их астроцитарных отростков неразрешимы методами световой и даже отдельными методами электронной микроскопии. Ввиду своей трудоёмкости исследования экспериментальной патологии мозга методами объёмной электронной микроскопии [1] до недавнего времени были сильно ограничены. Внедрение автоматизированных методов подготовки образцов и их анализа на основе машинного зрения и искусственного интеллекта значительно облегчает эту задачу.
В данном исследовании методами просвечивающей электронной микроскопии и 3D-реконструкций в Str. radiatum СА1 области гиппокампа крыс в хронической литий-пилокарпиновой модели эпилепсии показано снижение числа синапсов с увеличением их размеров наряду со снижением астроцитарной изоляции активных зон. Сочетание таких факторов, как снижение плотности глиальной изоляции увеличенных активных зон и, как следствие, облегчение диффузии нейротрансмиттера к активным синапсам может оказывать мультипликативный эффект на развитие эпилептиформной активности и эксайтотоксичности.
Это «упрощение» астроцитарной сети при эпилепсии сходно с таковым в 2/3 слое соматосенсорной коры мозга, по сравнению со слоем 1. При этом известно, что пирамидные нейроны слоя 2/3 потенциально способны к эпилептиформной активности при снижении тормозного влияния слоя 1, что позволяет использовать структурно-функциональные особенности верхних слоев коры в качестве природной клеточной модели развития эпилепсии.
Снижение Ca2+-событий в отростках астроцитов в литий-пилокарпиновой модели эпилепсии может быть связано с низкой буферной ёмкостью ионов Ca2+ гладкого эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и/или с нарушением передачи волны Ca2+ посредством щелевых контактов между астроцитарными отростками. Для анализа щелевых контактов необходимо высокое разрешение, а для визуализации цистерн гладкого ЭПР в перисинаптических отростках астроцитов — специальные методы его выявления.
Мы разработали оригинальные методы окраски гладкого эндоплазматического ретикулума [2], что позволило количественно оценить щелевые контакты и цистерны ЭПР в астроцитарных сетях в 1 и 2/3 слоях соматосенсорной коры. Площадь щелевых контактов в пересчёте на объём астроцита в слое 1 в 2 раза превышала значения в слое 2/3. Зеркальные отношения были получены для объёма гладкого ЭПР: в слое 2/3 суммарный объём цистерн ретикулума в пересчёте на объём астроцитарных отростков в ткани в 2 раза превышал значения в слое 1 [3]. При этом в эпилепсии мы наблюдаем двукратное увеличение площади отдельного астроцитарного щелевого контакта на фоне снижения кальциевых событий.
Полученные результаты позволяют предполагать существование в норме баланса между буфером ионов Ca2+ (гладким ЭПР) и щелевыми контактами, нарушение которого могло бы способствовать развитию судорожных состояний.