Perisynaptic astrocytic processes (PAP) involved in the tripartite synapse respond to local depolarization activation with calcium release from intracellular stores inside astrocytic process nodes, resulting in local and generalized calcium events [1, 2]. Electrophysiology and imaging experiments demonstrate the existence of Ca2+ stores in astrocytic peripheral processes. However, the initial electron microscopic studies suggested that terminal astrocytic processes (TAP), in contact with synapse and located near the axon-spine interface, lack organelles, including the main astrocytic Ca2+ store — the cisternae of the smooth endoplasmic reticulum (sER) [3]. The Ca2+-dependent release of gliotransmitters
Here, we conducted the first comprehensive analysis of TAP in murine hippocampal and cortical synapses, using serial section transmission electron microscopy and 3D reconstructions. The use of alternative approaches to brain tissue fixation and ultrathin staining allowed to increase the contrast of subunit membranes, such as those in sER cisternae of neurons and astrocytes [4, 5]. However, this technique increased the contrast of individual glycogen granules, which obscured cross-sections of sER cisternae due to their similarity in appearance to glycogen granules. To overcome this, we used the rapid disassembly of glycogen during non-anesthetic euthanasia to reveal sER cisternae in astrocyte processes. The removal of glycogen granules from astrocyte sections allowed the clear observation of the long sER cisternae. These cisternae have a diameter ranging from 30 to 60 nm and exhibit similar electron contrast to that of sER cisternae found in neuronal dendrites, including their specialized form in dendritic spines (spine apparatus). In addition to the extended sER cisternae, the PAP cytoplasm contains cross-sections of contrast structures that measure between 10 and 30 nm in diameter. When observed at low magnification, with a final image resolution of 1.7 nm per pixel, these structures appear morphologically and dimensionally indistinguishable from glycogen granules. Analysis at higher magnifications, with a working image resolution of 0.67–0.34 nm/pixel — ten to fifteen times higher than standard scanning electron microscopy resolution — enabled clear identification of membrane-bound organelles.
Serial sections analysis reveals that PAP structures contain two distinct pools of organelles: short (~130–170 nm) “filiform” cisternae of sER with a diameter of 10–30 nm and microvesicles. Additionally, if PAPs with branchlet morphology feature two types of sER cisternae (short “filiform” and extended dilated cisternae) and microvesicles, then TAP membrane organelles are represented only by fragments of short “filiform” sER cisternae and microvesicles. Groups of these slender cisternae and small vesicles are commonly found in close proximity to the active zones of the most active synapses. The non-random distribution of sER cisternae and microvesicles indicates the presence of an active mechanism for directed transport of membrane organelles within highly flattened TAP lamellae. We analyzed our results alongside existing immunoelectron microscopy data from the literature that examines the location of the Ca2+-binding protein calreticulin, a specific sER marker, in PAP. The observed thin sER cisternae serve as an ultrastructural foundation and primary contributor to the development of spontaneous and induced Ca2+ events in the PAPs, as well as a requirement for Ca2+-dependent vesicular release of gliotransmitters located near active synapses.
Despite the well-established belief that organelles are absent in TAP, the data suggest a dynamic regulation of organelle composition and number within PAP lamellae, dependent on synapse activity. These findings open new avenues for investigating neuron-glia interaction and the functional role of astrocytic microenvironments in tripartite synapse plasticity and pathological processes in the brain.
Перисинаптические отростки астроцитов (PAP), участвуя в работе трёхчастного синапса, отвечают на его активацию локальной деполяризацией с высвобождением ионов Ca2+ из внутриклеточных депо в узлах ветвления отростков и проявляют локальные или генерализованные кальциевые события [1, 2]. Результаты этих электрофизиологических и имиджинговых экспериментов предполагают наличие в периферических отростках астроцитов депо ионов Ca2+. Однако по результатам первых электронно-микроскопических исследований сформировалось устойчивое мнение, что терминальные отростки астроцитов (TAP), контактирующие с синапсом и лежащие в непосредственной близости к интерфейсу «аксон–шипик», лишены каких-либо органелл, включая основное депо ионов Ca2+ астроцитов — цистерны гладкого эндоплазматического ретикулума (sER) [3]. По этой же причине существует серьезный скептицизм и в отношении Са2+-зависимого высвобождения глиотрансмиттеров
В данной работе с использованием просвечивающей электронной микроскопии и 3D-реконструкции на серийных срезах мы провели первый детальный анализ TAP в синапсах гиппокампа и коры мозга мыши. Применение альтернативных методов фиксации ткани мозга и контрастирования ультратонких срезов [4, 5] позволило усилить контраст элементарных мембран, включая мембраны цистерн sER нейронов и астроцитов. Однако данный подход усиливал и контраст гранул гликогена, маскирующих сходные с гранулами гликогена сечения цистерн sER. Для демаскирования цистерн sER в отростках астроцитов мы воспользовались быстрой разборкой гликогена в результате неанестетической эвтаназии. Освобождение от гранул гликогена профилей астроцитов позволило отчетливо наблюдать протяжённые цистерны sER, сходные по диаметрам (30–60 нм) и электронному контрасту с цистернами sER дендритов нейронов и его производному в дендритных шипиках — шипиковому аппарату. Наряду с протяжёнными цистернами sER цитоплазма PAP содержала сечения контрастных структур диаметром 10–30 нм, которые на малых увеличениях, с финальным разрешением изображения 1,7 нм/пиксель, по морфологии и размерам не отличались от гранул гликогена. Анализ на больших увеличениях, с рабочим разрешением 0,67–0,34 нм/пиксель изображения, что в 10–15 раз превышает стандартное разрешение сканирующей электронной микроскопии, позволил четко идентифицировать такие объекты, как органеллы, имеющие мембранную природу.
Анализ серийных срезов показывает, что данные структуры в PAP составляют два пула органелл: короткие, длиной ~130–170 нм, «нитевидные» цистерны sER с диаметром 10–30 нм и микровезикулы. При этом если PAP с морфологией тонких веточек содержат два типа цистерн sER (короткие «нитевидные» и протяжённые расширенные цистерны) и микровезикулы, то мембранные органеллы в TAP представлены лишь короткими фрагментами «нитевидных» цистерн sER и микровезикулами, группы которых имеют тенденцию располагаться в непосредственной близости от активных зон наиболее активных синапсов. Такое нестохастическое распределение цистерн sER и микровезикул предполагает существование механизма активного направленного транспорта мембранных органелл в сильно уплощённых ламеллах TAP. Сопоставление с литературными данными иммуноэлектронной микроскопии о расположении в PAP специфического маркера sER, Са2+-связывающего белка кальретикулина, позволяет считать наблюдаемые нами тонкие цистерны sER как ультраструктурной основой и первичным звеном в развитии спонтанных и индуцированных Ca2+-событий в TAP, так и необходимым условием для Са2+-зависимого везикулярного высвобождения глиотрансмиттеров вблизи активных синапсов.
Несмотря на устоявшееся мнение об отсутствии органелл в TAP, полученные данные предполагают существование динамической регуляции состава и числа органелл в ламеллах PAP в зависимости от активности синапса и открывают новые перспективы в исследованиях нейрон-глиального взаимодействия и понимании функциональной роли астроцитарного микроокружения в пластичности трёхчастного синапса и развитии патологических процессов в мозге.