Neuronal transcription factors regulate the expression of receptors and intracellular signaling molecules involved in excitatory neurotransmission. The transcription factor Satb1 received significant attention for its role in regulating the growth and development of various types of brain neurons in both embryonic and postnatal periods. The depletion of the transcription factor Satb1 can be considered a fundamental mechanism for triggering hyperexcitation in the neural network, given the alterations in the activity and expression levels of proteins, such as glutamate receptors, protein kinases, and cell viability regulators. Although numerous studies were conducted on the role of Satb1 in neurogenesis, none showed any changes in intracellular calcium signaling or protein expression levels following Satb1 deletion in neurons.
Mice with complete (Satb1-null) and partial (Satb1-deficient) deletion of the Satb1 transcription factor were used in this study. Neuroglial cultures were obtained from the cerebral cortex of neonatal mice and were cultivated in-vitro for ten days. The cells were then loaded with a calcium-sensitive Fura-2 fluorescent probe and the dynamics of cytosolic Ca2+ ([Ca2+]i) were recorded using a fluorescent microscope. Spontaneous calcium activity was observed in the cell cultures, and epileptiform activity was modeled using conventional methods, i.e. the medium was depleted of magnesium (magnesium-free model) and 10 µM bicuculline was added (bicuculline model). The control group comprised cerebral cortex cells obtained from normal mice. To analyze expression patterns of genes encoding kinases, total RNA was extracted from cell cultures, and real-time PCR analysis was conducted.
Complete and incomplete deletion of the transcription factor Satb1 had distinct effects on protein kinase expression and genes that regulate cell viability. Satb1-deficient neurons exhibited increased expression of phosphoinositide-3-kinase, protein kinase C, protein kinase B, mitogen-activated protein kinase, as well as Bcl-2, Creb, and Nf-kB genes. The deletion of Satb1 in cortical neurons led to increased expression of only phosphoinositide-3-kinase, while the expression of all other studied protein kinases decreased in the presence of pro-inflammatory factors Nf-kB, Caspase-3, and Tnfα.
At the neurotransmission level, the complete deletion of Satb1 led to heightened spontaneous Ca2+ neuron activity alongside amplified Ca2+ oscillation frequencies and amplitudes when modeling epileptiform activity. Since hyperexcitation of the network is a symptom observed in neuronal networks during hypoxia, and the response of neurons to hypoxia is dependent on the activity of the kinases being studied, experiments were conducted to simulate hypoxia using neurons obtained from mice who lack the Satb1 transcription factor. Concurrently with recording [Ca2+]i, we measured pO2 using a somatic oximeter. The drop in pO2 signified the start of Ca2+ responses in neurons. Initially appearing in 8–10% of cells, hypoxia-triggered the first Ca2+ responses in WT neurons when pO2 dropped to 40 mm Hg. The remaining cells within the microscope field of view did not react. Satb1-null neurons responded to hypoxia at 60 mm Hg, exhibiting high-amplitude Ca2+ oscillations in over 15% of cells. Furthermore, Satb1-deficient neurons exhibited high-frequency Ca2+ oscillations and an increase in [Ca2+]i baseline to a new stationary level when pO2 decreased to 75–80 mm Hg. With over 20% of neurons responding, this suggests that Satb1-null neurons are more sensitive to hypoxia.
Нейрональные факторы транскрипции регулируют экспрессию многих рецепторов и внутриклеточных сигнальных молекул, участвующих в возбуждающей нейротрансмиссии. Большое внимание уделяется транскрипционному фактору Satb1 с точки зрения его вклада в регуляцию роста и развития различных типов нейронов головного мозга как в эмбриональном, так и в постнатальном периодах. Изменение уровня экспрессии и активности таких белков, как рецепторы глутамата, протеинкиназы и регуляторы жизнеспособности клеток, при делеции фактора транскрипции Satb1 можно считать одним из ключевых фундаментальных механизмов, определяющих запуск нейронной сети в состояние гипервозбуждения. Несмотря на достаточное количество работ, посвящённых роли Satb1 в нейрогенезе, отсутствуют исследования, демонстрирующие изменения внутриклеточной передачи сигналов кальция и уровня экспрессии белков при его делеции в нейронах.
В исследовании использовали мышей с полной (Satb1-null) и частичной (Satb1-deficient) делецией транскрипционного фактора Satb1. Нейроглиальные культуры коры мозга получали из новорожденных мышей и культивировали в течение 10 суток
Оказалось, что полная и неполная делеция транскрипционного фактора Satb1 по-разному влияли на экспрессию протеинкиназ и генов-регуляторов жизнеспособности клеток. В нейронах с дефицитом Satb1 происходило повышение экспрессии генов, кодирующих фосфоинозитид-3-киназу, протеинкиназу С, протеинкиназу В, митоген-активируемую протеинкиназу, а также гены Bcl-2, Creb, Nf-kB. Тогда как полная делеция Satb1 в корковых нейронах вызывала повышение экспрессии только фосфоинозитид-3-киназы, экспрессия всех остальных исследованных протеинкиназ снижалась на фоне повышения провоспалительных факторов Nf-kB, Caspase-3 и Tnfα.
На уровне нейротрансмиссии, полная делеция Satb1 приводила к повышенной спонатнной Са2+-активности нейронов, а также большим частотам и амплитудам Са2+-осцилляций при моделировании эпилептиформной активности. Поскольку симптом гипервозбуждения сети показан в нейрональных сетях при гипоксии и реакции нейронов на гипоксию зависят от активности исследованных нами киназ, были проведены эксперименты по моделированию гипоксии в нейронах, полученных из мышей с делецией транскрипционного фактора Satb1. Одновременно с регистрацией [Ca2+]i производилось измерение парциального давления кислорода (рO2) c помощью соматического оксиметра. Пороговым значением уменьшения рO2 считали начало генерации Са2+-ответов в нейронах. Появление первых Са2+-ответов на гипоксию в WT-нейронах происходило в 8–10% клеток, когда парциальное давление кислорода снижалось до 40 мм рт.ст, при этом остальные клетки в поле зрения микроскопа не реагировали. Satb1-null нейроны начинали реагировать на гипоксию при 60 мм рт.ст, причем Са2+-ответы имели вид высокоамплитудных Са2+-осцилляций, регистрируемых в более чем 15% клеток. При этом Satb1-null нейроны реагировали появлением высокочастотных Са2+-осцилляций с выходом базового уровня [Ca2+]i на новый стационарный уровень уже при снижении рO2 до 75–80 мм рт.ст, а с учётом высокого процента (более 20%) отвечающих нейронов, можно говорить о повышенной чувствительности Satb1-null нейронов к гипоксии.