BACKGROUND: Genes of the NeuroD family, including NeuroD1, NeuroD2, and NeuroD6, control neuronal survival, differentiation, maturation, and neurite specification in the nervous system. Deletion of NeuroD1 in the mouse brain results in complete loss of dentate gyrus because of neuronal apoptosis. NeuroD2 is required for neuron survival in the cerebellum and integration of thalamo-cortical connections into neocortex and formation of somatosensory whisker barrel cortex. In NeuroD2/6 double deficient (DKO) mice, callosal axon projections are defective due to abnormal EfnA4 signaling. In order to investigate the NeuroD2/6 controlled molecular cascade, we explored the expression of key transcription factors that control various aspects of cortical development in brains of NeuroD2 and NeuroD6 deficient mutants.
AIM: To investigate possible changes in differentiation programs downstream of NeuroD2/6 transcription factors.
METHODS: Embryos with NeuroD2/6 double deficiency were used in the experiments, and pregnant mice carrying E13.5 embryos were operated for in utero electroporation. We performed in situ hybridization at various stages of embryonic development to study the expression pattern of target genes. Analyzing the activity of a gene promoter, genomic DNA fragments containing NeuroD2/6 motifs were cloned into pMCS-Gaussia Luc vector for luciferase assays. Charts were made with GraphPad Prism software and data were presented as mean ± standard error.
RESULTS: Our findings showed that NeuroD1 expression is ectopically upregulated in postmitotic neurons of NeuroD2/6 DKO neocortex and hippocampus. We detected changes in expression of key transcription factors, Cux1, Tbr1, Lhx2, and Id2. Additionally, Cux1 was shown to be direct target of NeuroD2/6. Moreover, Olig2+ progenitors were increased in NeuroD2/6 DKO neocortex and expression of NeuroD2/6 and Olig2 was mutually exclusive. Thus, NeuroD2/6 regulates the expression of transcription factors in the developing brain.
CONCLUSION: Our findings indicate that cumulative action of NeuroD2 and NeuroD6 is required to initiate and maintain the expression of transcription factors Cux1, Tbr1, Lhx2, and Id2. Additionally, both genes are required to prevent premature differentiation of Olig2 positive glial precursors.
Обоснование. Гены семейства NeuroD, включая NeuroD1, NeuroD2, NeuroD6, контролируют выживаемость, дифференцировку, созревание нейронов и формирование нейритов в нервной системе. В мозге мышей делеция NeuroD1 приводит к полной потере зубчатой извилины гиппокампа вследствие апоптоза нейронов. NeuroD2 необходим для выживания нейронов в мозжечке и интеграции таламокортикальных связей в новой коре, а также для формирования соматосенсорной коры. В недавних работах авторов показано, что у мышей с двойным дефицитом NeuroD2/6 аксоны мозолистого тела дефектны из-за нарушений передачи сигналов, опосредованных белком EfnA4. Для того чтобы охарактеризовать молекулярные каскады, регулируемые белками NeuroD2/6, авторы исследовали экспрессию ключевых факторов транскрипции, которые контролируют различные аспекты развития коры головного мозга у мышей с дефицитом NeuroD2 и NeuroD6.
Цель исследования — изучение возможных изменений программ дифференцировки транскрипционных факторов, связанных с NeuroD2/6.
Методы. В экспериментах использовали эмбрионы с двойным дефицитом NeuroD2/6. Генотип определяли методом полимеразной цепной реакции. Беременных мышей, несущих эмбрионы E13.5, оперировали для внутриутробной электропорации. Для изучения паттерна экспрессии генов-мишеней проводили in situ гибридизацию с синтетической РНК на разных стадиях эмбрионального развития. Для анализа активности промоторов соответствующих генов фрагменты геномной ДНК, содержащие мотивы связывания NeuroD2/6, клонировали в вектор pMCS-GL для измерения активности люциферазы. Относительные количественные данные анализировали с помощью парного одностороннего t-критерия Стьюдента. Графики сделаны с помощью программного обеспечения GraphPad Prism и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка.
Результаты. Установлено, что экспрессия NeuroD1 эктопически активируется в постмитотических нейронах неокортекса и гиппокампа в двойном нокауте NeuroD2/6. Обнаружено также, что экспрессия транскрипционных факторов Cux1, Tbr1, Lhx2, Id2 нарушена в двойном нокауте NeuroD2/6. Показано, что Cux1 является прямой мишенью NeuroD2/6. Кроме того, выявлено, что количество предшественников Olig2+ увеличивается в неокортексе мышей с двойным нокаутом NeuroD2/6, а экспрессия NeuroD2/6 и Olig2 является взаимоисключающей. Таким образом, установлено, что NeuroD2/6 регулируют экспрессию нескольких факторов транскрипции в развивающемся мозге.
Заключение. Кумулятивное действие обоих генов необходимо для инициации и поддержания экспрессии факторов транскрипции Cux1, Tbr1, Lhx2, Id2 и Olig2.