Faculty of Basic medicine, Lomonosov Moscow State University, Moscow
Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
LLC «MONA», Moscow
000 «Фирма МОНА», Москва
LLC «MONA», Moscow
000 «Фирма МОНА», Москва
LLC «MONA», Moscow
000 «Фирма МОНА», Москва
LLC «MONA», Moscow
000 «Фирма МОНА», Москва
Institute of experimental cardiology, Russian cardiology research center, Moscow
Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, Москва
Institute of experimental cardiology, Russian cardiology research center, Moscow
Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, Москва
Institute of experimental cardiology, Russian cardiology research center, Moscow
Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, Москва
Institute of experimental cardiology, Russian cardiology research center, Moscow
Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, Москва
LLC «Gene and Cell therapy», Moscow
000 «Генная и клеточная терапия», Москва
LLC «MONA», Moscow
000 «Фирма МОНА», Москва
Institute of experimental cardiology, Russian cardiology research center, Moscow
Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий, Москва
Efficacy of critical limb ischemia gene therapy can be improved by application of novel plasmid vectors with higher transgene expression. The goal of this study is to evaluate in vitro and in vivo expression of angiogenic growth factors after gene transfer using a novel plasmid vector PC4W. Plasmid constructs with genes of human VEGF185 CpC4W-hHGFopt), HGF CpC4W-hHGFopt) and angiopoietin-1 (pC4W-hAng-1optJ were tested in vitro in a HEK293T cell culture. Cells were subjected to calcium-phosphate transfection and conditioning medium samples were assayed for transgene levels using Western blot and ELISA. Results were compared with commercially available pcDNA3 based vectors encoding the same growth factors. Reverse transcription PCR was used to assay transgene expression in BALB-c mice ischemic muscle. ELISA and Western blotting data suggest that PC4W based constructs give a higher protein output of about 2-2,5 fold compared with pcDNA3 based plasmids. Optimization of nucleotide sequence in growth factors cDNA results in additional increase in transgene expression. RT-PCR data shows that expression of human HGF persists in murine ischemic skeletal muscle up to 14 days after gene transfer. Our results indicate that novel plasmid constructs for angiogenic growth factors expression have a good efficacy in vitro and in vivo and can be used for VEGF1B5, HGF and angiopoietin-1 expression in human cell culture and in experimental animals' tissue. At the moment all developed constructs pass through a series of experiments in animal ischemia models and will be used for combined gene therapy development.
Одним из путей увеличения эффективности генной терапии критической ишемии нижних конечностей является создание векторов, обладающих высокой экспрессионной активностью. В данной работе нами испытывался плазмидный вектор PC4W, имеющий ряд регуляторных элементов, которые позволяют повысить экспрессию трансгена в клетках и тканях животных. Плазмидные конструкции на базе вектора PC4W, несущие кДНК генов человеческого HGF CpC4W-hHGFopt), VEGF1B5 (pC4W-hVEGFopt) и ангиопоэтина-1 (pC4W-hAng-1opt), испы-тывались in vitro в культуре клеток НЕК293Т. Уровень факторов роста после кальций-фосфатной трансфекции оценивался по данным вестерн-блоттинга и ИФА и сравнивался с коммерческими плазмидами pcDNA3, несущими гены аналогичных ростовых факторов. Для оценки экспрессии факторов роста в ишемизированной ткани мышей BALB-c использовался метод ПЦР с обратной транскрипцией. Данные иммуноблоттинга и ИФА кондиционных сред транс-фецированных клеток показали, что при использовании вектора PC4W уровень факторов роста удалось повысить в 2-2,5 раза по сравнению с коммерческими плазмидами pcDNA3. Дополнительное увеличение экспрессии достигается за счет оптимизации нуклеотидных последовательностей экспрессируемых генов. Методом ПЦР было показано, что в течение 14 сут. в ишемизированной ткани сохраняется мРНК человеческого HGF, что соответствует данным литературы. Полученные результаты показывают, что новые плазмидные конструкции, предназначенные для экспрессии ангиоген-ных факторов роста как in vitro, так и in vivo, обладают высокой активностью в культуре клеток человека и в тканях животных и позволяют продуцировать факторы hVEGF1B5, hHGF и hAng-1 в более высоких количествах, чем конструкции на базе коммерческого вектора pcDNA3, несущего неоптимизированные последовательности генов этих факторов. Конструкции в настоящий момент проходят предклинические испытания на моделях ишемии у экспериментальных животных и в дальнейшем будут использованы для разработки комбинированной генной терапии ишемических заболеваний.