The potential of the automated cell culture system CompacT SelecT (TAP Biosystems, UK) allows using it for the large scale production of dermal fibroblasts for cell therapy. Automated maintenance and expansion of fibroblasts requires evaluation of the proper seeding density and defining the time for the achievement of the optimal confluency of cell monolayer for further passaging. Objective - to determine the optimal parameters of dermal fibroblasts passaging for development of standardized protocol for automated cell cultivation using CompacT SelecT system. Human dermal fibroblasts were isolated from donor skin samples by enzyme dissociation. Cells proliferation rate was evaluated by the calculation of proliferation index. The dependence of proliferation rate from cell monolayer density was determined using the value of average number of divisions of single cell per day. The dependence of fibroblasts proliferation rate from seeding density (from 50 to 1.2х104cells/cm2) in various periods of cultivation (3rd, 5th, 7th and 9th day) was investigated. The inverse correlation between proliferation rate and seeding density, together with dramatic decrease of proliferation rate at fibroblasts monolayer confluency of (3.5-4.5)х104 cells/cm2, was demonstrated. The optimal seeding density was evaluated as 3х103 cells/ cm2, the most suitable density of cell monolayer for further passaging was evaluated as 3.5х104 cells/cm2. In case of high seeding density (1.2х104 cells/cm2), on day 7, when the cell monolayer density reached the critical value, the cell extinction occured, followed by renewal of cell growth. This phenomenon may be explained by the selection of cells capable of replication under conditions of high density of monolayer.
Возможности роботизированной станции по культивированию и пересеву клеточных линий CompacT SelecT (TAP Biosystems, Великобритания) позволяют использовать ее для экспансии дермальных фибробластов, показанных для клинического применения. Автоматизация культивирования клеток требует оптимизации этого процесса, в том числе подбора наиболее подходящей исходной дозы фибробластов и определения времени достижения клеточным монослоем оптимальной плотности для пересева. Цель работы - определение оптимальных параметров пассирования дермальных фибробластов для стандартизации протокола их автоматизированного культивирования с помощью роботизированной станции CompacT SelecT. Дермальные фибробласты человека были получены из фрагментов кожи доноров методом ферментативной диссоциации. В качестве показателя пролиферативной активности использовали индекс пролиферации. Изменение скорости пролиферации в зависимости от плотности клеточного монослоя определяли по среднесуточному количеству делений на одну клетку. Влияние посевной дозы (от 50 до 1,2х104 кл/см2) на пролиферативную активность фибробластов оценивали в разные сроки эксперимента (3, 5, 7 и 9 сут. культивирования). Была установлена обратная зависимость пролиферативной активности фибробластов от величины посевной дозы и показано резкое снижение скорости пролиферации фибробластов после достижения клеточным монослоем плотности 3,5-4,5х104 кл/см2. В результате проведенного исследования было обнаружено, что оптимальная исходная доза фибробластов составляет 3х103 кл/см2, а наиболее подходящая для проведения дальнейшего пересева плотность монослоя - 3,5х104 кл/см2. В посевах с высокой исходной плотностью (1,2х104кл/см2) при достижении клеточным монослоем критической плотности на 7 сут. наблюдалась гибель части клеток, что сопровождалось возобновлением роста клеточной популяции на 9 сут. культивирования. Данный феномен может объясняться селекцией клеток, способных существовать в условиях повышенной плотности монослоя.