Huntington's disease is an autosomal dominant neurodegenerative disorder caused by trinucleotide repeats expansion mutation in the first exon of HTT gene. Neurodegenerative disorders are difficult to study due to limited material availability and late onset of the manifestation. In vitro cell models provide a good opportunity to study molecular mechanisms of the pathology. New genome editing approaches allow us to generate isogenic cell lines that can be useful for drug screening and studying mechanisms of molecular and cellular events triggered by certain mutation on an equal genetic background. The aim of our work was establishing a method to introduce expanded CAG repeat tract into HTT gene by homology directed repair. We used a genome editing tool based on CRISPR/Cas9 system to facilitate the process. A donor construct bearing 215 CAG trinucleotide repeats flanked with long homology arms was generated. The method was approved on the HEK293Phoenix cell line. Mutant clones were obtained. It was shown that mutant HTT protein is expressed in the HEK293 mutant clones and affect their viability and proliferation rate.
Болезнь Хантингтона - это аутосомно-доминантное нейродегенеративное заболевание, обусловленное мутацией экспансии тринуклеотидных повторов в первом экзоне гена НТТ. Нейродегенеративные расстройства с трудом поддаются изучению из-за ограниченной доступности материала и позднего начала клинического проявления, поэтому клеточные модели in vitro предоставляют хорошую возможность для изучения молекулярных механизмов развития патологии. Новые подходы редактирования генома позволяют получать клеточные линии, которые могут служить в качестве моделей наследственных заболеваний, и дают возможность получения изогенных пар клеточных линий, которые обеспечат адекватный контроль для исследований. В работе представлен метод введения в геном культивируемых клеток динамической мутации экспансии повтора CAG с помощью гомологичной рекомбинации. Для повышения частоты рекомбинационных событий использовали систему CRISPR/Cas9, позволяющую направленно и специфично вносить двуцепочечные разрывы ДНК в геном клеток. Сконструирована донорная молекула, несущая 215 тринуклеотидных повторов CAG, фланкированных длинными плечами гомологии к первому экзону гена НТТ, которая служила матрицей для гомологичной рекомбинации. Эффективность метода была проверена на клеточной линии HEK293 Phoenix. Получены клоны клеток, несущие как встройки тринуклеотидных повторов CAG в гене НТТ (55-215 триплетов), так и делеции протяженных участков первого экзона НТТ (до 561 п.н.). Показано, что наличие мутации в геноме клеток линии НЕК293 Phoenix влияет на их жизнеспособность и скорость пролиферации.