The purpose of this study is to develop the strategies of CRISPR/Cas9 application to improve fidelity and specificity of this platform. Here we use a model system, which includes target gene and a paralogue - potential aim for off-target double-strand break induction. The study was carried on using Brattleboro rats embryonic fibroblasts which are homozygous for a mutation in arginine-vasopressin gene (target). The potential off-target gene is oxytocin gene: its DNA sequence is almost identical to that of arginine-vasopressin gene. To prevent off-target effect we designed several strategies, which were further used on Brattleboro rats embryonic fibroblasts. Here we show, that these strategies allowed us to generate double-strand breaks in arginine-vasopressin gene without any off-target effects in oxytocin gene. The endonuclease restriction assay shows that we have modified arginine-vasopressin gene while using both CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides as a donor for homologous recombination. At last, if we consider Brattleboro rats as a model of monogenic disease the strategies designed could be translated in human therapeutic genome editing studies.
Данная работа посвящена разработке стратегий применения системы CRISPR/Cas9 для увеличения специфичности и точности этого метода на модельной системе, состоящей из целевого гена и гена-паралога, для которого существует риск внесения нецелевых двунитевых разрывов. Нами были использованы эмбриональные фибробласты крыс линии Brattleboro, геном которых содержит гомозиготную мутацию в гене гормона аргинин-вазопрессина (целевой ген). При внесении модификаций в ген аргинин-вазопрессина потенциальной мишенью нецелевого действия CRISPR/Cas9 в рамках предложенной нами модельной системы является ген гормона окситоцина - паралог целевого гена с практически идентичной последовательностью ДНК. Для предотвращения нецелевого эффекта в гене гормона окситоцина был разработан ряд стратегий использования CRISPR/Cas9, которые затем были применены на эмбриональных фибробластах крыс линии Brattleboro. Показано, что при использовании всех разработанных стратегий с помощью системы CRISPR/Cas9 удалось внести двунитевые разрывы в ген аргинин-вазопрессина без нецелевых эффектов в гене окситоцина. С помощью рестрикционного анализа показано, что при использовании одноцепочечных олигонуклеотидов в качестве донорных молекул для гомологичной рекомбинации происходит внесение модификаций в целевой участок гена гормона аргинин-вазопрессина крыс линии Brattleboro. Наконец, если рассматривать крыс данной линии в качестве модели наследственных заболеваний моногенной природы, то разработанные в работе стратегии могут быть использованы при исправлении мутаций, вызывающих болезни человека, и как следствие, при терапии наследственных заболеваний человека с помощью современных методов редактирования геномов.