Genes & CellsGenes & CellsГены и КлеткиGenes and Cells2313-18292500-2562Human Stem Cells Institute12050710.23868/gc120507ArticlesСтатьиResearch ArticleEfficiency of IL-2 and IL-15 combined use for activation of cytotoxic lymphocytes in vitroЭффективность совместного применения IL-2 и IL-15 для активации цитотоксических лимфоцитов in vitroAbakushinaE. VАбакушинаЕ. Вabakushina@mail.ruMarizinaYu. VМаризинаЮ. ВNeprinaG. SНепринаГ. СA. Tsyb Medical Radiological Research Centre - branch of the National Medical Research Radiological CentreМедицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал Национального медицинского исследовательского радиологического центра15062015102VOL 10, NO2 (2015)ТОМ 10, №2 (2015)788505012023Copyright ©; 2015, Eco-VectorCopyright ©; 2015, Эко-Вектор2015Eco-VectorЭко-Векторhttps://genescells.ru/2313-1829/article/view/120507

0ne of the modern approaches for cancer treatment is based on the application of immunotherapy using activated cytotoxic lymphocytes. Search of methodological approaches for the preparation of activated lymphocytes in vitro is relevant. As a result of this study, the method for activation and culturing of lymphocytes for cancer patients have been perfected using cytokine IL-2 and IL-15. Peripheral mononuclear cells of cancer patients were culture using two different mediums based on RPMi-1640 with IL-2 for 10 days and X-vivo20 supplemented with IL-2 and IL-15 for 14 days. The expression of activation markers (CD38, CD69, CD25, HLA-DR and CD314) and subpopulations of lymphocytes were evaluated by the method of flow cytometry every 2 days. The expression of activation markers of lymphocytes increased after 3 days of culture in the first medium and after 5 days in the second one. We revealed that the activation of lymphocytes was faster in medium based on RPMI with IL-2, but the proliferation and viability of lymphocytes were lower than in the second medium. The culture medium based on RPMI with IL-2 can be recommended for more quickly obtaining of lymphokine-activated killer cells. The medium based on X-vivo20 with a combination of IL-2 and IL-15 can be recommended for a longer cultivation of lymphocytes and for escalating of lymphokine-activated killer cells. it has been shown that the combination of cytokines IL-2 and IL-15 not only has a positive influence on the proliferation activity of the lymphocytes and the expression of activation markers, but also on their viability.

Одним из современных подходов к лечению пациентов со злокачественными новообразованиями является применение иммунотерапии с использованием активированных цитотоксических лимфоцитов. В этой связи актуален поиск методологических подходов для получения активированных лимфоцитов in vitro В результате данного исследования был усовершенствован метод активации и длительного культивирования лимфоцитов онкологических больных с использованием цитокинов IL-2 и IL-15. Культивирование периферических мононуклеарных клеток (ПМК) больных раком желудка, толстой кишки и почки проводили с использованием разных сред на основе RPMi-1640 c IL-2 в течение 10 дней и X-vivo20 с добавлением IL-2 и IL-15 в течение 14 дней. Цитофлуориметрическим методом каждые 2 сут. оцененивались экспрессия маркеров активации (CD38, CD69, CD25, HLA-DR и CD314) и субпопуляционный состав лимфоцитов. При культивировании ПМК в первой среде было отмечено увеличение экспрессии маркеров активации лимфоцитов после 3 дня, а во второй среде после 5 дня. Выявлено, что активация лимфоцитов в среде на основе RPMI с IL-2 происходит быстрее, однако пролиферация и жизнеспособность лимфоцитов были несколько ниже, чем во второй среде, поэтому ее можно рекомендовать для быстрого получения лимфокин-активированных клеток киллеров. Среду же на основе X-vivo20 с комбинацией цитокинов IL-2 и IL-15 можно рекомендовать для длительного культивирования и наращивания активированных лимфоцитов. Было показано, что комбинация цитокинов IL-2 и IL-15 позитивно влияет не только на пролиферативную активность клеток и экспрессию маркеров активации, но и на их жизнеспособность

IL-2IL-15lymphocyte cultureactivated lymphocytes in vitroIL-2IL-15activation markersLAK-cellsNK-cellsкультивирование лимфоцитовактивация лимфоцитов in vitroмаркеры активацииЛАК-клеткиNK-клеткиБережной А.Е., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П. и др. Молекулярные механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы Вопр. онкол. 2008; 54(6): 669-83.Абакушина Е.В., Кузьмина Е.Г., Коваленко Е.И. Основные свойства и функции NK-клеток человека. Иммунол. 2012; 33(4): 220-4Закеева И.Р., Бережной А.Е., Гнучев Н.В. и др. Ингибиторные рецепторы лимфоцитов и их роль в противоопухолевом иммунитете. Вопр. онкол. 2007; 53(2): 140-9.Sabry M., Lowdell M.W. Tumor-primed NK cells: waiting for the green light. Front. Immunol. 2013; 4(408): 1-7.Shen Y., Lu C., Tian W. et al. Possible association of decreased NKG2D expression levels and suppression of the activity of natural killer cells in patients with colorectal cancer. Int. J. Oncol. 2012; 40(4): 1285-90.Курилин В.В., Хантакова Ю.Н., Облеухова И.А. и др. Стимуляция дендритными клетками in vitro противоопухолевой цитотоксической активности мононуклеарных клеток больных колоректальным раком. Мед. иммунол. 2013; 15(3): 235-46.Нехаева Т.Л. Оптимизация аутологичных дендритно-клеточных вакцин для лечения больных злокачественными новообразованиями. Сиб. онкол. журн. 2013; 57(3): 52-6.Титов К.С., Киселевский М.В., Демидов Л.В. и др. Внутрибрюшинная биотерапия с использованием ИЛ-2 и донорских ЛАК-клеток при метестатических асцитах у больных раком яичников. Росс. биотерапевт. журн. 2011; 10(2): 51-4.Георгиев Г.П., Ларин С.С., Сащенко Л.П. и др. Вакцинотерапия опухолей модифицированными геном TAG7 опухолевыми клетками. Молекул. мед. 2008; 4: 1-9.Cheng M., Chen Y., Xiao W. et al. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Cell. Mol. Immunol. 2013; 3(10): 1-23.Kimura H., Yamaguchi Y. A phase III randomized study of interleukin-2 lymphokine-activated killer cell immunotherapy combined with chemotherapy or radiotherapy after curative or noncurative resection of primary lung carcinoma. Cancer 1997; 80(1): 42-9.Todaro M., Orlando V., Cicero G. et al. Chemotherapy sensitizes colon cancer initiating cells to Vy9VS2 T cell-mediated cytotoxicity. PloS One. 2013; 6(8): 1-8.Sangiolo D., Martinuzzi E., Todorovic M. et al. Alloreactivity and anti-tumor activity segregate within two distinct subsets of cytokine-induced killer (CIK) cells: implications for their infusion across major HLA barriers. Int. Immunol. 2008; 20(7): 841-8.Boiardi A., Silvani A., Ruffini P.A. et al. Locoregional immunotherapy with recombinant interleukin-2 and adherent lymphokine-activated killer cells (A-LAK) in recurrent glioblastoma patients. Cancer Immunol. Immunother. 1994; 39(3): 193-7.Wang F.S., Liu M.X., Zhang B. et al. Antitumor activities of human autologous cytokineinduced killer (CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo. World J. Gastroenterol. 2002; 8(3): 464-8.Литвинова Л.С., Гуцол А.А., Сохоневич Н.А. и др. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т-лимфоцитов Мед. иммунол. 2014; 16(1): 7-26.Sandoval-Montes C., Santos-Argumedo L. CD38 is expressed selectively during the activation of a subset of mature T-cells with redused proliferation but improved potential to produce cytokines. Leukocyte Biol. 2005; (77): 513-21.Clausen J., Vergeiner B., Enk M. et al. Functional significance of the activation-associated receptor CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells. Immunobiol. 2003; 207(2): 85-93.Чикилева И.О., Анисимова Н.Ю., Верескунова Н.В. и др.; ЗАО «БИОКАД». Способ получения активированных лейкоцитов для адъювантной адаптивной иммунотерапии злокачественных новообразований. Патент РФ 2414915. 27. 03. 2011.Киселевский М.В. Адоптивная иммунотерапия при злокачественных новообразованиях. Вест. РАН. 2003; (1): 40-4.Koyama S. Augmented human-tumorocytolytic activity of peripheral blood lymphocytes and cells from a mixed lymphocyte/ tumor culture activated by interleukin-12 plus interleukin-2, and the phenotypic characterization of the cells in patients with advanced carcinoma. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1997; 123(9): 478-84.Демидов Л.В., Михайлова И.Н., Синельников И.Е. и др. Проблемы клинического применения ИЛ-2/ЛАК-терапии. Росс. Биотерапевт. журн. 2005; 4(4): 29-37.Яковлев В.Н., Зыков Д.В., Алексеев В.Г. и др.; Яковлев В. Н. Способ лечения больных раком легкого. Патент РФ 2500435. 10. 12. 2013.Киселевский М.В., Анисимова Н.Ю., Соснов А.В.; Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН. Способ получения активированных мононуклеарных лейкоцитов. Патент РФ 2402338. 27. 10. 2010.Абакушина Е.В. Определение функциональной активности естественных киллеров человека методом проточной цитофлуориметрии. Клинико-лаб. консил. 2011; 39(3): 17-25.Абакушина Е.В. Влияние углеводов, представленных на поверхности клеток-мишеней, на цитолитическую активность естественных киллеров человека [диссертация]. Москва; РГМУ; 2002De Maria A., Bozzano F., Cantoni C. et al. Revisiting human natural killer cell subset function revealed cytolytic CD56(dim)CD16 + NK cells as rapid producers of abundant iFN-gamma on activation. PNAS USA. 2011; (108): 728-32.Lin S.J., Lee P.T., Kuo M.L. Cytokine activation of natural killer cells. Methods Mol. Biol. 2014; (1139): 223-9.Rodella L., Zamai L., Rezzani R. et al. interleukin 2 and interleukin 15 differentially predispose natural killer cells to apoptosis mediated by endothelial and tumour cells. Br. J. Haematol. 2001; 115(2): 442-50.Naora H., Gougeon M. Activation, survival and apoptosis of CD45R0+ and CD45R0- T cells of human immunodeficiency virus-infected individuals: effects of interleukin-15 and comparison with interleukin-2. immunology 1999; 97(2): 181-7.Litvinova L.S., Sokhonevich N.A., Gutsol A.A. et al. influence of immunoregulatory cytokines (iL-2, iL-7 and iL-15) in vitro upon activation, proliferation and apoptosis of immune memory T-cells]. Tsitologiia 2013; 55(8): 566-71.