Genes & CellsGenes & CellsГены и КлеткиGenes and Cells2313-18292500-2562Human Stem Cells Institute12037010.23868/gc120370ArticlesСтатьиResearch ArticleIntracellular localization analysis of a conjugate of recombinant histone H1.3 with photoactivated fluorescent dyeАнАлиз внутриклеточной локАлизАции конъюгАтА рекомбинАнтного гистонА H1.3 с фотоАктивируемым флуоресцентным крАсителемShaposhnikovM. NШапошниковМ. НSolovyevaD. OСоловьеваД. ОZaitsevS. YuЗайцевС. ЮSolovyevaV. VСоловьеваВ. ВSalafutdinovI. IСалафутдиновИ. ИRizvanonA. AРизвановА. АK.I. Skryabin Moscow State Academy of Veterinary Medicine and BionanotechnologyМосковская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. СкрябинаNational Research Nuclear University «MEPI»Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. СкрябинаK.I. Skryabin Moscow State Academy of Veterinary Medicine and BionanotechnologyКазанский (Приволжский) федеральный университетKazan (Volga region) Federal UniversityНациональный исследовательский ядерный университет «МИФИ»Kazan (Volga region) Federal UniversityКазанский (Приволжский) федеральный университетКазанский (Приволжский) федеральный университетНациональный исследовательский ядерный университет «МИФИ»1509201493VOL 9, NO3 (2014)ТОМ 9, №3 (2014)28929405012023Copyright ©; 2014, Eco-VectorCopyright ©; 2014, Эко-Вектор2014Eco-VectorЭко-Векторhttps://genescells.ru/2313-1829/article/view/120370

Histone proteins are promising carriers for delivery of recombinant nucleic acids in various cell cultures. Conjugates of proteins with fluorescent dyes are modern tools in the study of cellular transport and intracellular distribution of important biopolymers. The aim of this work was to optimize the method of recombinant histone H1.3 conjugation with photoactivatable fluorescent dye. Also we studied intracellular penetration and subcellular localization of the resulting conjugate. Resulting conjugate was capable of intensive fluorescence in the red region of the spectrum after irradiation with violet light. The degree of conjugation was determined under different reaction conditions. A comparison of the cytotoxicity of histone H1.3 and its conjugate with photoactivated fluorescent dye in HeLa cells and its intracellular localization was characterized. We found that conjugates mainly localize in recycling endosomes and to a lesser extent in peroxisomes. Thus, the resulting conjugate of recombinant histone H1.3 with photoactivatable fluorescent dye can be used for further studies its anticancer activity and as carrier for drugs and nucleic acids delivery into human and animal cells.

Гистонные белки являются перспективными носителями для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в различные культуры клеток. Получение конъюгатов таких белков с флуоресцентными красителями является современным инструментом в исследовании клеточного транспорта и внутриклеточного распределения важных биополимеров. Целью данной работы являлась оптимизация методики конъюгации рекомбинантного гистона H1.3 и фотоактиви-руемого флуоресцентного красителя, исследование проникновения полученного конъюгата в клетки и определение его внутриклеточной локализации. В ходе работы оптимизирована методика получения конъюгата, способного интенсивно флуоресцировать в красной области спектра, после облучения фиолетовым светом. Определена степень конъюгации при разных условиях. Проведено сравнение цитотоксичности гистона Н1.3 и его конъюгата с фотоакти-вируемым флуоресцентным красителем (ФФК) в культуре клеток HeLa, а также его внутриклеточная локализация. Обнаружено, что коньюгаты в значительной степени концентрируются в рециркулирующих эндосомах, в меньшей степени - в пероксисомах. Таким образом, полученный конъюгат рекомбинантного гистона Н1.3 с ФФК может быть в дальнейшем использован для исследований его противоопухолевого действия и как носителя для доставки лекарственных препаратов и нуклеиновых кислот в клетки человека и животных.

recombinant histone H1.3conjugationintracellular imagingfluorescent dyesphotoactivationрекомбинантный гистон H1.3конъюгациявнутриклеточная визуализацияфлуоресцентные красителифотоактивацияСоловьева В.В., Кудряшова Н.В., Ризванов А.А. Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция) с помощью гистонов и других ядерных белков. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2011; 6(3): 29-40.Соловьева В.В., Исаев А.А., Генкин Д.Д. и др. Влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективность лентивирусной трансдукции клеток человека in vitro. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 7(3): 151-4.Belov V.N., Wurm C.A., Boyarskiy V.P. et al. Rhodamines NN: a novel class of caged fluorescent dyes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2010; 49(20): 3520-3.Зайцев С.Ю., Шапошников М.Н., Свирщевская Е.В. Окрашивание клеток новыми фотоактивируемыми флуоресцентными красителями. Ветеринарная медицина 2010; 3: 32-4.Шапошников М.Н., Чудаков Д.Б., Генералов А.А. и др. Получение конъюгата хитозана с фотоактивируемым флуоресцентным красителем и его применение в клеточной микроскопии. Ветеринарная медицина. 2012; 3-4: 32-5.Lidke D.S., Wilson B.S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 2009; 19(11): 566-74.Lippincott-Schwartz J., Snapp E., Kenworthy A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001; 2(6): 444-56.Neher R.A., Mitkovski M., Kirchhoff F. et al. Blind source separation techniques for the decomposition of multiply labeled fluorescence images. Biophys. J. 2009; 96(9): 3791-800.Betzig E., Patterson G.H., Sougrat R. et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science 2006; 313(5793): 1642-5. финансировалась грантом РФФИ 13-04-97099. Рекомбинантный гистон Н1.3 предоставлен ОАО «Институт стволовых клеток человека». Работа частично выполнена на оборудовании междисциплинарного центра аналитической микроскопии (директор Осин Ю.Н., оператор Кузнецова С.В,) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.Hess S.T., Girirajan T.P., Mason M.D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 2006; 91(11): 4258-72.Rust M.J., Bates M., Zhuang X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 2006; 3(10): 793-5.Шапошников М.Н., Зайцев С.Ю., Чудаков Д.Б. и др. Определение локализации нового фотоактивируемого флуоресцентного красителя в культуре клеток A431 с помощью селективных флуоресцентных зондов. Учен. За. Казан. Гос. Акад. Вет. Мед. им. Н.Э. Баумана. 2013; 214: 483-8.Шапошников М.Н., Чудаков Д.Б., Генералов А.А. и др. Зависимость флуоресценции нового фотоактивируемого красителя от параметров среды. Фундаментальные исследования 2012; 9(2): 322-7.Zaitsev S.Y., Shaposhnikov M.N., Solovyeva D.O. et al. Novel precursors of fluorescent dyes. 1. Interaction of the dyes with model phospholipid in monolayers. Cell Biochem. Biophys. 2013; 67(3): 1365-70.Zaitsev S.Y., Shaposhnikov M.N., Solovyeva D.O. et al. Cell Staining by Novel Derivatives of Fluorescent Rhodamine Dyes. World Appl. Sci. J. 2013; 26(6): 712-8.Goedhart J., von Stetten D., Noirclerc-Savoye M. et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93%. Nat. Commun. 2012; 3: 751.Choudhury A., Dominguez M., Puri V. et al. Rab proteins mediate Golgi transport of caveola-internalized glycosphingolipids and correct lipid trafficking in Niemann-Pick C cells. J. Clin. Invest. 2002; 109(12): 1541-50.