Altering Receptor Specificity of a Recombinant Adeno-Associated Virus Enables Its Targeting to Human Melanoma Cells

Full Text

Введение

Аденоассоциированные вирусы (AAV) – это небольшие икосаэдрические вирусы без липопротеиновой мембраны, принадлежащие к роду Dependoparvovirus семейства Parvoviridae. Они не патогенны для человека и способны реплицироваться в клетках только в присутствии вируса-помощника (адено- или герпесвируса). Геном AAV длиной около 4,7 тысяч оснований представляет собой одноцепочечную ДНК с двумя генными регионами – Rep и Cap [1]. Регион Rep кодирует 4 белка, участвующих в репликации и транскрипции вирусного генома (Rep78, Rep68, Rep52, Rep40), а регион Cap кодирует 3 капсидных белка (VP1, VP2, VP3). Также в геноме закодированы три минорные открытые рамки считывания (ORF), кодирующие вспомогательные белки AAP, MAAP и X [2]. На концах вирусной ДНК расположены инвертированные концевые повторы (ITR), играющие важную роль в инициации репликации и упаковке генома в капсид [1]. В качестве первичных рецепторов для связывания с клеткой AAV используют углеводные цепи гликопротеинов, заякоренных в плазматической мембране, (гепарансульфат, сиаловые кислоты, концевую галактозу), а в качестве вторичных рецепторов, обеспечивающих интернализацию вируса, большой спектр разнообразных молекул (FGFR1, c-MET, HGFR, LamR, CD9, aVb5-интегрины и другие) [3]. Небольшие различия в аминокислотных последовательностях капсидных белков определяют специфичность взаимодействия отдельного серотипа AAV с тем или иным первичным и вторичным рецептором, а, следовательно, и предпочтение типа клеток, который данный серотип может инфицировать. Также недавно был обнаружен универсальный клеточный рецептор, участвующий в инфекции AAV – AAVR [4]; однако данные о его взаимодействии с вирусом разнятся: он может участвовать как в интернализации на поверхности клетки, так и в связывании в ранней эндосоме, или способствовать переходу из транс-Гольджи сети в цитоплазму [5].

В настоящее время AAV являются, вероятно, наиболее предпочтительным вариантом вирусной доставки генов в клетки человека с целью терапевтического воздействия. Это обусловлено рядом причин: низкой иммуногенностью, длительной экспрессией целевого гена без интеграции в геном реципиента, широким выбором серотипов с тропизмом к определённой ткани организма [3]. Также важно, что современные системы трёхплазмидной сборки рекомбинантных AAV позволяют получить вектор, кодирующий исключительно трансген и не содержащий ни одного вирусного гена, что повышает безопасность применения в клинической практике [6]. Тенденции последних 15 лет показывают, что AAV начинают превалировать в качестве генотерапевтических векторов в сравнении с двумя другими популярными системами вирусной доставки генов – аденовирусами и ретровирусами (включая лентивирусные векторы). Это подтверждается ростом числа публикаций, связанных с использованием AAV [7], увеличением количества зарегистрированных клинических исследований [2] и наличием девяти официально одобренных к применению лекарств на основе AAV [8].

Одной из актуальных задач при разработке AAV-векторов является создание капсидов со сниженной иммуногенностью, увеличенной эффективностью трансдукции и повышенной специфичностью к органу или ткани, на которые предполагается оказывать терапевтическое воздействие. В капсидной инженерии рекомбинантных вирусов существует несколько подходов: рациональный дизайн, направленная эволюция и компьютерный анализ с алгоритмами предсказания [9]. Рациональный дизайн капсидов основывается на известных экспериментальных данных о связывании вируса с рецепторами на плазматической мембране и процессах его дальнейшего перемещения внутри клетки. Внесение аминокислотных замен или инсерций в определённые участки аминокислотной последовательности капсидного белка AAV позволяет поменять рецепторную специфичность вируса [10] или снизить его деградацию в протеасомах [11]. Направленная эволюция капсидов состоит в использовании больших библиотек случайных точечных мутаций или пептидных вставок и последовательном отборе вирусов с нужными характеристиками в культуре клеток [12]. Наконец, большие перспективы имеет применение компьютерного анализа, позволяющего предсказать аминокислотную последовательность капсидного белка AAV с заданными свойствами [13].

Мы решили применить метод рационального дизайна капсидов для создания рекомбинантного AAV с повышенной специфичностью по отношению к клеткам злокачественной меланомы, наиболее опасного опухолевого заболевания кожных покровов человека [14]. В качестве специфичного маркера данной опухоли уже давно рассматриваются aVb3-интегрины, чья повышенная экспрессия играет ключевую роль в реализации инвазивного потенциала меланомы [15]. aVb3-интегрины, как и ряд других представителей этого семейства рецепторов, распознают в своих лигандах уникальный пептидный мотив – аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD в однобуквенном коде) [16]. Высокая специфичность данного связывания послужила основой для разработки терапевтических препаратов, использующих RGD-последовательность, для нацеливания на интегрины [17]. Ранее Hölig et al. с помощью метода фагового дисплея отобрали несколько RGD-пептидов, связывающихся с высокой аффинностью с клетками меланомы человека [18]. В этих пептидах RGD-мотив стабилизирован одной или двумя дисульфидными связями за счёт цистеинов, фланкирующих интегрин-связывающий сайт. Последовательности этих пептидов были, в свою очередь, использованы нами при создании рекомбинантных белков, специфически связывающихся со злокачественными меланоцитами. В частности, мы получили и испытали в модельных системах тетрамерные RGD-содержащие стрептавидины [19] и ряд RGD-апоптинов, селективно запускающих апоптоз в клетках меланомы человека [20]. В данном исследовании один из этих RGD-пептидов был использован для изменения рецепторной специфичности AAV-вектора, с целью дальнейшего применения для доставки генов, кодирующих цитолитические белки, в клетки меланомы человека.

Цель

Разработка рекомбинантного AAV, селективно заражающего клетки меланомы человека.

Материалы и Методы

Бактериальные штаммы, плазмиды, культуры клеток человека

В работе были использованы штамм E.coli Top10, плазмиды pRC2-mi342, pHelper, pAAV-ZsGreen1 (все – Takara Bio, Япония), линии клеток человека 293FT (Invitrogen, США), MeWo (ATCC HTB-65^TM, США) и HaCaT. Клеточная линия HaCaT была любезно предоставлена профессором М.А. Лагарьковой (ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина). Культуры клеток растили в среде DMEM (Servicebio, Китай) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (HyClone Cytiva, США) и гентамицина (HiMedia, Индия) в конечной концентрации 50 мкг/мл в CO₂-инкубаторе при +37°C. В случае клеток 293FT в среду дополнительно добавляли G-418 (Gibco, США) в конечной концентрации 500 мкг/мл.

Конструирование плазмид

Сборка плазмиды, кодирующей мутантный капсидный белок AAV, осуществлялась методом PIPE (Polymerase Incomplete Primer Extension) [21] с модификациями. Вначале с помощью ПЦР получали два фрагмента плазмиды с перекрывающимися по последовательности концами. Для наработки фрагментов использовали пары праймеров AAVpipe15-F и RC2pipe-R, а также AAVpipe15-R и RC2pipe-F (см. табл. 1). В качестве ДНК-матрицы использовалась плазмида pRC2-mi342. Амплификацию проводили с помощью высокоточной ДНК-полимеразы Phusion High Fidelity (Thermo Fisher Scientific, США). Условия ПЦР для наработки фрагментов: предварительная денатурация 98°С 30 секунд 1 цикл, (98°С 10 секунд/60°С 20 секунд/72°С 3 минуты 30 секунд) 35 циклов, финальная элонгация 72°С 10 минут 1 цикл. Полученные фрагменты ДНК очищали в 1% агарозном геле и выделяли из него колоночным набором diaGene (Диа-М, Россия). Далее два фрагмента смешивали в молярном соотношении 1:1, трансформировали смесью компетентные клетки штамма E.coli Top10 и растирали по чашкам Петри с агаризованной средой LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина. На следующий день проверяли выросшие клоны с использованием ПЦР с парой праймеров AAVcap-scF и AAVcap-scR. Далее засевали несколько клонов в пробирки с 3 мл жидкой среды LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, инкубировали в шейкере при +37°С и 225 об/мин в течение ночи, и на следующий день выделяли из них плазмиды колоночным набором diaGene (Диа-М, Россия). Нуклеотидные последовательности выделенных плазмид проверяли секвенированием по Сенгеру. Бактериальный клон, содержащий плазмиду с верифицированной нуклеотидной последовательностью, засевали в 125 мл жидкой среды LB с ампициллином и инкубировали на шейкере в течение ночи при +37°С и 225 об./мин. Плазмиды для трансфекции клеток человека выделяли макропрепаративно с использованием набора Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Германия).

Получение рекомбинантных AAV в культуре клеток

Клетки линии 293FT рассевали по культуральным флаконам Т225 и растили до 80% конфлюэнтности на среде DMEM с 10% FBS, гентамицином и G-418. Для трансфекции готовили смесь трёх плазмид в среде Opti-MEM (Gibco, США): pAAV-ZsGreen1 (36 мкг) + pHelper (36 мкг) + плазмида, кодирующая капсид (pRC2-mi342 или pRC2-RGD15, 36 мкг). К каждой смеси плазмидной ДНК по каплям добавляли среду Opti-MEM с 200 мкг полиэтиленимина PEI MAX (Polysciences, США), соотношение PEI:ДНК 1,85:1. Смеси PEI с плазмидной ДНК инкубировали 20 минут при комнатной температуре и по каплям добавляли к клеткам 293FT. Клетки инкубировали при +37°С в атмосфере 5% CO₂ в течение 20 часов, после чего производили замену среды на DMEM с 2% FBS. Спустя трое суток после трансфекции производили сбор вирусного урожая. К клеткам со средой добавляли 500 мкл 0.5М ЭДТА (1/80 от объёма среды) и инкубировали с одновременным покачиванием в течение 10 минут при комнатной температуре. Сошедшие с подложки клетки переносили в стерильные 50 мл пробирки с коническим дном и центрифугировали в угловом роторе на 1750 g в течение 10 минут при +4°С. После центрифугирования супернатант сливали, а клеточные осадки ресуспендировали в 10 мл раствора Хэнкса (Servicebio, Китай), переносили в стерильные 15 мл пробирки и повторно центрифугировали на 1750 g в течение 10 минут при +4°С. Супернатант сливали, а осадки ресуспендировали в 3 мл раствора Хэнкса и замораживали на -80°С.

Выделение и очистка рекомбинантных AAV

Экстракцию вирусных частиц из клеток осуществляли трёхкратным замораживанием/оттаиванием (-80°С/+37°С). Клеточные лизаты центрифугировали на 9000 g в течение 10 минут при +4°С. Супернатанты переносили в новые пробирки и добавляли фермент крионазу (Takara Bio, Япония) в количестве 1/100 от объёма (30 мкл/600 единиц), а также 1/100 от объёма стерильного 1 М MgCl₂ (до конечной концентрации 10 mM), после чего инкубировали смесь 30 минут при +37°С. Далее проводили центрифугирование на 9000 g в течение 10 минут при +4°С. Супернатант переносили в новые пробирки и добавляли 1/10 от объёма раствора SD (Takara Bio, Япония) для осаждения белков, после чего инкубировали смесь ещё 30 минут при +37°С. Далее проводили центрифугирование на 9000 g в течение 10 минут при +4°С. Полученные супернатанты пропускали через 0,45 мкм фильтры и концентрировали в амиконах Ultra-15 100K (Merck Millipore, США) на центрифуге с бакет-ротором на 2000 g при +15°С в течение 45 минут, учитывая дополнительную промывку раствором Хэнкса. Итоговые титры вирусов оценивали с помощью ПЦР в реальном времени с использованием набора AAVpro Titration kit Ver.2 (Takara Bio, Япония).

Трансдукция клеток рекомбинантными AAV

Трансдукцию клеток рекомбинантными AAV проводили в формате 96-луночных культуральных планшетов. Клетки линий MeWo и HaCaT растили до 75% конфлюэнтности, после чего заражали вирусами. Для оценки эффективности инфекции вирусы добавляли к клеткам в среде DMEM с 2% FBS, инкубировали клетки в течение суток в атмосфере 5% CO₂ при +37°С, затем тщательно отмывали от вирусов и добавляли среду DMEM с 10% FBS, после чего инкубировали ещё одни сутки в CO₂-инкубаторе. Далее клетки снимали с подложки трипсином, центрифугировали планшеты на центрифуге при 500 g в течение 5 минут при комнатной температуре и промывали осадок клеток раствором Хэнкса. По 120 мкл клеточной суспензии переносили в лунки круглодонного планшета и анализировали на проточном цитофлуориметре NovoCyte (Agilent, США). Эффективность трансдукции определяли по флуоресценции белка ZsGreen1 (GFP канал). В опытах по оценке кинетики связывания с рецепторами рекомбинантные AAV (в количестве 3000 MOI) инкубировали с клетками MeWo в среде DMEM с 2% FBS в течение различных временных интервалов. В опытах по конкурентному ингибированию гепарин (ОАО «Синтез», Россия) или пептиды добавляли к клеткам MeWo в среде DMEM с 2% FBS за полчаса до добавления вируса (в количестве 3000 MOI), инкубация с рекомбинантными AAV длилась 2 часа, анализ клеток на проточном цитофлуориметре проводили спустя двое суток. Все эксперименты проводили в трёх биологических повторах.

Пептидный синтез

Пептиды (см. табл. 2) были получены методом твердофазного синтеза по Fmoc-стратегии c использованием автоматического синтезатора Liberty Blue (CEM Corp., США), оснащённого микроволновым подогревом реакционной смеси. Очистка пептидов производилась методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на хроматографе с УФ-детекцией Akta Pure (GE Healthcare Life Sciences, США), используя колонку Zorbax SB-C18 (Agilent, США). В ручном режиме осуществляли сбор фракций, которые соответствовали мажорным пикам на хроматограмме на стадии элюции. После окончания очистки использовали систему ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией Shimadzu LCMS-2020 (Shimadzu, Япония) для подтверждения качественного состава всех собранных фракций. По результатам масс-спектрометрического анализа делали выводы о составе хроматографических пиков, фракции с соответствующим для исследуемого пептида набором отношений масс иона к их заряду объединяли и далее производили контроль чистоты. После подтверждения хроматографической чистоты (не менее 95%) растворы пептидов лиофилизировали на установке ScanVac Coolsafe 110-4 Pro (Labogene, Дания) и хранили до использования при температуре +4℃.

Результаты

Получение рекомбинантного AAV с RGD-пептидом в капсидном белке

Для получения рекомбинантных вирусов нами была использована трёхплазмидная система, являющаяся на сегодняшний день одной из самых простых и удобных систем для сборки AAV. Одна из этих плазмид кодирует трансген, который будет нести рекомбинантный вирус, другая – капсидные и репликативные белки AAV, и третья – белки и регуляторные РНК вируса-помощника (в нашем случае аденовируса). Для создания вируса с RGD-пептидом в капсиде, в первую очередь мы провели инсерционный мутагенез плазмиды pRC2-mi342, кодируюшей капсидный белок AAV серотипа 2 (далее AAV2). Также стоит отметить, что данная плазмида кодирует микроРНК человека hsa-miR-342, способствующую увеличению титра вирусных частиц при сборке. Мутагенез проводили с помощью метода PIPE [21], позволяющего вставлять нуклеотидные последовательности в вектор бесшовно, не используя нецелевые последовательности (например, сайты рестрикции или рекомбинации). Относительно оригинальной методики нами были внесены небольшие изменения в процесс получения плазмиды по варианту M-PIPE. В частности, трансформация компетентных клеток E.coli производилась не единым фрагментом линеаризованной плазмиды, а двумя фрагментами (частями) плазмиды, которые после ПЦР дополнительно очищались путём электрофореза в агарозном геле и последующего выделения колоночным набором. Данные модификации метода PIPE позволяют избавиться от клонов, содержащих плазмиду дикого типа, которая используется в качестве матрицы на этапе ПЦР-амплификации. Нуклеотидная последовательность плазмиды, получившей наименование pRC2-RGD15, была верифицирована секвенированием по Сенгеру (рис. 1A), а кодируемый ей капсидный белок AAV имел вставку пептида RGD15 (DGFPGCRGDCSQE) после остатка аспарагина в 587-м положении аминокислотной последовательности (рис. 1B).

Далее была проведена сборка двух рекомбинантных AAV в культуре клеток человека 293FT: с капсидом AAV2 дикого типа и с мутантным капсидом, содержащим пептид RGD15. Оба вируса несли в своём геноме экспрессионную кассету, кодирующую зелёный флуоресцентный белок ZsGreen1 кораллового полипа Zoanthus sp. Продукция данного белка в клетках, заражённых рекомбинантными AAV, использовалась нами далее для оценки эффективности трансдукции. После сборки вирусов, их очистки и концентрирования было получено 0,8 мл вируса AAV2-ZsGreen1 с титром 9,5×10⁹ вг/мл и 0,8 мл вируса AAV-RGD15-ZsGreen1 с титром 1,3×10¹⁰ вг/мл. Интересно, что AAV с пептидом RGD15 в капсиде собирается воспроизводимо лучше, чем AAV с капсидом дикого типа (подтверждено результатами трёх независимых сборок).

Оценка эффективности трансдукции клеток человека рекомбинантными AAV

Оценка инфекционности полученных вирусов была проведена на двух клеточных линиях кожного происхождения: MeWo и HaCaT. Злокачественные меланоциты кожи MeWo являются хорошо известной и часто используемой моделью для исследований меланомы человека. В свою очередь линия HaCaT была выбрана в качестве контрольной не только потому, что представляет собой нормальные (незлокачественные) кератиноциты кожи, но и по причине отсутствия экспрессии b3-субъединицы интегриновых рецепторов (the Human Protein Atlas database¹), являющейся мишенью для пептида RGD15. Вирусы добавляли к клеткам в четырёх вариантах множественности инфекции (MOI) и оценивали эффективность трансдукции методом проточной цитометрии по количеству ZsGreen1-позитивных клеток. На клетках MeWo оба вируса продемонстрировали близкие показатели инфекционности. При MOI 1000 AAV2-ZsGreen1 заражал 52,8±1,1% злокачественных меланоцитов, а AAV-RGD15-ZsGreen1 – 35,7±5,0%. При MOI 3000 разница в эффективности трансдукции между двумя вирусами сокращалась до минимальных значений: AAV2-ZsGreen1 заражал 94,5±0,3% клеток, AAV-RGD15-ZsGreen1 заражал 90,0±0,3% клеток (рис .2А). В то же время при заражении линии HaCaT ситуация принципиально менялась: при MOI 1000 вирус с мутантным капсидом инфицировал всего 6,9±1,5% клеток, а уровень трансдукции кератиноцитов вирусом с капсидом дикого типа был близок показателям, полученным на MeWo – 41,7±7,7% (рис. 2B). При увеличении MOI разница в эффективности трансдукции между двумя вирусами хотя и сокращалась, но всё равно оставалась значительной. При MOI 3000 AAV2-ZsGreen1 заражал 76,2±1,1% клеток, AAV-RGD15-ZsGreen1 заражал 28,5±3,7% клеток (разница в 2,7 раза). При MOI 10000 AAV2-ZsGreen1 заражал 92,1±1,7% клеток, AAV-RGD15-ZsGreen1 заражал 49,9±4,8% клеток (разница в 1,8 раза). В целом можно констатировать, что рекомбинантный AAV с капсидом, содержащим инсерцию пептида RGD15, демонстрируя высокий уровень заражения клеток меланомы (на уровне AAV с капсидом дикого типа), имеет сниженные показатели эффективности трансдукции нормальных кератиноцитов при тех же значениях MOI.

Для оценки кинетики связывания двух вирусов с рецепторами клеток линии MeWo была выбрана MOI 3000, обеспечивающая сопоставимую эффективность заражения обоими вирусами при 24-часовой инкубации. Эффективность инфицирования при данном значении MOI анализировали через 1, 2, 4, 6, 8 и 24 часа инкубации вируса с клетками (рис. 3). Вирус с капсидом дикого типа уже через 1 час инфицировал 37,1±2,3% злокачественных меланоцитов, а к 8 часам показатель эффективности трансдукции достигал 76,3±1,3%. При этом мутантный вирус за 1 час заражал лишь 3,6±0,3% клеток, а через 8 часов эффективность трансдукции AAV-RGD15-ZsGreen1 составляла 33,8±6,2% (т.е. ниже, чем у AAV2-ZsGreen1 спустя 1 час). Эти результаты показывают, что скорость связывания с клеточными рецепторами у вируса с инсерцией RGD-пептида в капсиде значительно ниже в сравнении с вирусом, обладающим капсидом дикого типа. Не исключено, что такая закономерность справедлива для всех рекомбинантных AAV с пептидными вставками в капсидной оболочке, и это кажется логичным, т.к. капсидные белки AAV дикого типа эволюционировали длительное время путём естественного отбора, и их аффинность к рецепторам должна быть максимально оптимизированной. Мы не нашли в научной литературе примеров сравнительного анализа кинетики связывания с рецепторами AAV с капсидом дикого типа и AAV с мутантными капсидами с пептидными инсерциями, так что вероятно, такая работа проведена впервые. С нашей точки зрения, это важные данные, которые частично могут объяснять некоторые противоречивые результаты, полученные при исследованиях AAV с модифицированными капсидами [22].

Анализ рецепторной специфичности рекомбинантных AAV

Для подтверждения изменения рецепторной специфичности AAV с мутантным капсидом были проведены опыты по конкурентному ингибированию заражения линии MeWo. Для анализа связывания вирусов с гепарансульфатом использовался структурно гомологичный ему гепарин. А для оценки связывания рекомбинантных AAV с интегринами применяли химически синтезированный пептид RGD15 (табл.2), идентичный по аминокислотной последовательности пептиду в капсиде AAV-RGD15-ZsGreen1. Результаты экспериментов представлены на рисунке 4. Так как кинетика связывания двух вирусов с рецепторами различается (см. выше), значения эффективности трансдукции были нормализованы по показателю относительной инфекционности, где за 1 единицу был принят процент ZsGreen1-позитивных клеток в культуре после инкубации с рекомбинантными AAV в количестве 3000 MOI в течение 2 часов без ингибиторов. Добавление гепарина приводило к дозозависимому снижению эффективности трансдукции злокачественных меланоцитов вирусом с капсидом дикого типа: при концентрации 500 мкг/мл инфекция клеток блокировалась практически полностью (рис. 4А). В то же время добавление гепарина к AAV с мутантным капсидом не влияло на заражение этим вирусом клеток MeWo. В опыте с добавлением к вирусам пептида RGD15, напротив, снижалась эффективность трансдукции AAV-RGD15-ZsGreen1, а на вирус AAV2-ZsGreen1 данный пептид не влиял (рис. 4B). В качестве дополнительного контроля был поставлен опыт с трансдукцией клеток в присутствии пептида со случайной последовательностью Random (табл. 2), обладающего схожим профилем гидрофильности с пептидом RGD15 (рис. 4C). Полученные результаты подтвердили, что связывание AAV-RGD15-ZsGreen1 со злокачественными меланоцитами в значительной степени обусловлено последовательностью RGD-пептида.

Обсуждение

AAV2 является наиболее изученным и используемым в клинических исследованиях аденоассоциированным вирусом [1]. Первичным рецептором для него является молекула гепарансульфата, представленная в составе протеогликанов на плазматических мембранах большинства клеток человека, что обеспечивает широкий тканевой тропизм данного вируса [6]. Если для некоторых вариантов клинических применений это может являться положительным свойством, то в случае использования вируса для генной терапии опухолей эту особенность AAV2 следует признать недостатком. Очевидно, что создание вирусных векторов, селективно заражающих злокачественные клетки, является приоритетной задачей в онкотерапии, и значительная доля усилий в этой области исследований направлена на её решение. Идентификация аминокислотных остатков капсидного белка AAV2, участвующих в связывании гепарансульфата [23], позволила применять метод рационального дизайна для изменения рецепторной специфичности данного вируса. Ранее было показано, что наилучшей позицией для вставки пептидов, изменяющих тропизм AAV, является петля VR-VIII капсидного белка. Инсерция пептидов после аминокислотного остатка Asn-587 или соседнего с ним Arg-588 не только обеспечивала взаимодействие вируса с новым клеточным рецептором, но и нарушала связывание мутантного AAV с гепарансульфатом [24]. В данной работе мы получили рекомбинантный аденоассоциированный вирус со вставкой тринадцатичленного пептида RGD15 после Asn-587 в капсидном белке и показали его селективность по отношению к клеткам меланомы человека. Этот пептид содержит RGD-мотив в правильной для распознавания интегринами конформации, стабилизированной фланкирующими трипептид цистеинами [25]. Ранее мы успешно использовали пептид RGD15 для нацеливания различных рекомбинантных белков на злокачественные меланоциты [19, 20]. Надо отметить, что RGD-пептиды являются одним из самых распространённых вариантов инсерций в капсиды AAV [24, 26, 27], но при этом работ, исследующих тропность таких вирусов по отношению к клеткам меланомы человека, до сих пор не проводилось.

В опытах по конкурентному ингибированию мы подтвердили, что инсерция пептида в капсид AAV2 меняет его рецепторную специфичность. Добавление гепарина не оказывало влияния на эффективность трансдукции клеток MeWo вирусом с мутантным капсидом. В свою очередь, эксперименты с добавлением пептидов продемонстрировали, что проникновение AAV-RGD15-ZsGreen1 в клетки меланомы обусловлено наличием в его капсидной оболочке пептида RGD15. Тем не менее, мутантный вирус всё-таки заражает клетки линии HaCaT, не экспрессирующие aVb3-интегрины, хотя и со значительно сниженной эффективностью. Это может иметь несколько объяснений. Во-первых, следует учитывать, что испытания вирусов проводились в модельной системе с одним типом клеток в статичной питательной среде. При этом основная роль первичного рецептора (гликанов в случае AAV) состоит, вероятно, в концентрировании вирусных частиц, распространяющихся кровотоком, на плазматической мембране клетки [28]. В случае лунок планшета, дно которых равномерно покрыто клетками, при достижении определённой концентрации вирусов в среде они так или иначе осядут на плазматическую мембрану (независимо от первичного рецептора), где смогут связаться cо вторичными рецепторами, ответственными за интернализацию. При этом весьма вероятно, что в живом организме распределение вирусов по органам и тканям будет отличаться от результатов, полученных в клеточных моделях. Во-вторых, не исключено, что использованный нами RGD-пептид связывается с другими интегриновыми рецепторами (не aVb3-) на поверхности клеток HaCaT, хотя и с меньшей аффинностью. Оценка широкого спектра RGD-пептидов на связывание с различными интегриновыми рецепторами показала, что добиться абсолютной селективности лиганда к конкретному рецептору тяжело [29]. И в третьих, несмотря на большой прогресс, достигнутый в последние годы в изучении механизмов проникновения AAV в клетку, многое в этом процессе остаётся не ясным, а часть экспериментальных данных противоречит друг другу [28]. Не исключено, что в процессе инфицирования клеток HaCaT вирусом с RGD-пептидом участвует какой-то рецептор, для которого роль в связывании и/или интернализации AAV пока не описана.

Очевидно, что проблема специфичности противоопухолевых лекарств является одной из ключевых в лечении злокачественных новообразований. С нашей точки зрения, одним из подходов к её решению может стать создание препаратов с двойной специфичностью по отношению к опухолевым клеткам. Такие препараты могут нести в себе сразу две молекулярные детерминанты, обеспечивающие избирательное действие на опухоль. В частности, рекомбинантные AAV могут одновременно нести на капсиде лиганд для взаимодействия с опухоль-специфическим рецептором и кодировать в своём геноме онколитический белок. Такие белки, вызывающие апоптоз в раковых клетках, но остающиеся неактивными по отношению к клеткам здоровым, хорошо описаны в научной литературе [30-32]. Одним из представителей группы онколитических полипептидов является апоптин – небольшой пролин-богатый белок вируса инфекционной анемии цыплят, который считается перспективной молекулой для разработки противораковых препаратов [33] и уже был апробирован нами в модельной системе клеток MeWo [20]. Использование разработанного нами AAV-вектора для доставки экспрессионной кассеты с апоптином в клетки злокачественной меланомы видится логичным продолжением данной работы.

Также хотелось бы упомянуть о ещё одном потенциальном преимуществе AAV с предлагаемым нами дизайном. Одной из проблем при генной терапии с использованием рекомбинантных AAV-векторов является наличие нейтрализующих антител к этим вирусам, вызванное предыдущими естественными инфекциями. Особенно это касается AAV2, одного из самых распространённых в человеческой популяции. Но, как ранее показали Huttner et al. [34], добавление сыворотки человека с AAV2-нейтрализующими антителами не влияет на трансдукцию вируса с мутантным капсидом, имеющего вставки пептидов в положении 587 аминокислотной последовательности капсидного белка (т.е. в том же положении, в которое вставлен пептид RGD15 у полученного нами вируса). Это позволяет надеяться, что вирус AAV-RGD15 не будет подвержен нейтрализации антителами при опытах in vivo, хотя, конечно, данное утверждение требует отдельной экспериментальной проверки.

Заключение

Рекомбинантные AAV на сегодняшний день являются одними из самых перспективных векторов для использования в генной терапии и уже активно используются в клинической практике. Рациональный дизайн капсидов AAV представляет собой достаточно удобный и простой подход для повышения селективности таких вирусов по отношению к тому или иному типу клеток. В данной работе мы разработали AAV-вектор, имеющий инсерцию пептида RGD15 в петле VR-VIII капсидного белка. В опытах на клеточных моделях MeWo и HaCaT было продемонстрировано, что такой мутантный вирус теряет способность эффективно заражать нормальные кератиноциты кожи, сохраняя, однако, способность проникать в клетки злокачественной меланомы.

¹ The Human Protein Atlas database; 2005– . [cited 2026 Apr 3]. Available from: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000259207-ITGB3/cell+line

Таблицы

Таблица 1. Праймеры, использованные в работе. Нуклеотидные последовательности, кодирующие пептид RGD15, выделены курсивом.

Table 1. Primers used in this study. Nucleotide sequences encoding the RGD15 peptide are shown in italics.

Таблица 2. Пептиды, использованные в работе. Аминокислотные последовательности приведены в однобуквенном коде.

Table 2. Peptides used in the study. Amino acid sequences are given in single-letter code.

Подрисуночные подписи

Рис. 1. Инсерционный мутагенез капсидного белка AAV2. A – выравнивание хроматограмм, полученных при секвенировании по Сенгеру плазмиды pRC2-RGD15 (кодирует капсидный белок AAV2 с инсерцией пептида RGD15, сверху) и плазмиды pRC2-mi342 (кодирует капсидный белок AAV2 дикого типа, снизу). Приведён фрагмент, соответствующий инсерции нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид RGD15. B – выравнивание фрагментов аминокислотных последовательностей (участок, включающий петлю VR-VIII) капсидных белков (VP1) вирусов AAV-RGD15-ZsGreen1 (сверху) и AAV2-ZsGreen1 (снизу). Нумерация аминокислотных остатков приведена по последовательности VP1 AAV-RGD15-ZsGreen1 (до Asn-587 нумерация аминокислотных остатков капсидных белков обоих вирусов совпадает).

Fig. 1. Insertional mutagenesis of the AAV2 capsid protein. A – alignment of chromatograms obtained by Sanger sequencing of plasmid pRC2-RGD15 (encoding the AAV2 capsid protein with the RGD15 peptide insertion, top) and plasmid pRC2-mi342 (encoding the wild-type AAV2 capsid protein, bottom). The fragment corresponding to the insertion of the nucleotide sequence encoding the RGD15 peptide is shown. B – alignment of amino acid sequence fragments (the region including the VR-VIII loop) of the capsid proteins (VP1) of viruses AAV-RGD15-ZsGreen1 (top) and AAV2-ZsGreen1 (bottom). The amino acid residue numbering is given according to the VP1 sequence of AAV-RGD15-ZsGreen1 (up to Asn-587, the amino acid residue numbering of the capsid proteins of both viruses is the same).

Рис. 2. Оценка эффективности трансдукции клеток человека вирусами AAV2-ZsGreen1 и AAV-RGD15-ZsGreen1. Каждая точка на графиках – среднее значение трёх биологических повторов ± стандартное отклонение. A – клетки злокачественной кожной меланомы человека MeWo. B – нормальные кератиноциты кожи человека HaCaT.

Fig. 2. Evaluation of the transduction efficiency of human cells with the AAV2-ZsGreen1 and AAV-RGD15-ZsGreen1 viruses. Each point on the graphs is the mean value of three biological replicates ± standard deviation. A – MeWo human malignant cutaneous melanoma cells. B – HaCaT normal human skin keratinocytes.

Рис. 3. Cравнительный анализ кинетики связывания вирусов AAV2-ZsGreen1 и AAV-RGD15-ZsGreen1 с рецепторами клеток MeWo. Каждая точка на графиках – среднее значение трёх биологических повторов ± стандартное отклонение.

Fig. 3. Comparative analysis of the binding kinetics of AAV2-ZsGreen1 and AAV-RGD15-ZsGreen1 viruses to receptors on MeWo cells. Each point on the graphs is the mean value of three biological replicates ± standard deviation.

Рис. 4. Анализ рецепторной специфичности рекомбинантных AAV2-ZsGreen1 и AAV-RGD15-ZsGreen1 на клетках MeWo. A – конкурентное ингибирование с использованием гепарина. B – конкурентное ингибирование с использованием пептида RGD15. C – конкурентное ингибирование с использованием пептида Random. Данные представлены как среднее значение трёх биологических повторов ± стандартное отклонение. Нормальность распределения и однородность дисперсий оценивались с помощью тестов Шапиро-Уилка и Левена соответственно. Поскольку в опыте с гепарином данные соответствовали предположениям о нормальности и не демонстрировали значительной гетерогенности дисперсий, сравнение групп проводилось с использованием дисперсионного анализа ANOVA Уэлча с последующим апостериорным тестом Геймса-Хоуэлла. В опыте с пептидами предположение о нормальности не всегда выполнялось, поэтому сравнение групп проводилось с использованием теста Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Статистическая значимость устанавливалась на уровне: ns – нет статистически значимых различий, ** — p < 0.01, *** — p < 0.001.

Fig. 4. Analysis of receptor specificity of recombinant AAV2-ZsGreen1 and AAV-RGD15-ZsGreen1 on MeWo cells. A – competitive inhibition with heparin. B – competitive inhibition with the RGD15 peptide. C – competitive inhibition assay with the Random peptide. Data are presented as the mean of three biological replicates ± standard deviation. Normality of distribution and homogeneity of variances were assessed using the Shapiro–Wilk test and the Levene test, respectively. As the data for the heparin experiment met the assumptions of normality and showed no significant heterogeneity of variances, group comparisons were performed using Welch’s ANOVA followed by the Games–Howell post hoc test. For the peptide experiment, the assumption of normality was not consistently satisfied, so group comparisons were performed using the Kruskal–Wallis test followed by pairwise comparisons with the Bonferroni correction for multiple comparisons. Statistical significance was set at the level: ns – no significance, ** – p < 0.01, *** – p < 0.001.

About the authors

Dmitriy Shirokov

Author for correspondence.
Email: dmitry.a.shirokov@gmail.com

Daria Lepekhina

Email: lepdauri@gmail.com

Margarita Bogomiakova

Email: margbog_5@mail.ru

Sabina Illarionova

Email: stadashi6@gmail.com

Vassili Lazarev

Email: lazar0@mail.ru

References

Supplementary files