The Effect of Antiseptics and Abrasives Used for the Treatment of Peri‑Implantitis on the Viability of Multipotent Human Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Full Text

Введение

Перициты играют ключевую роль в процессах регенерации костной, хрящевой, соединительной и жировой тканей. Сохранение их жизнеспособности и функциональной активности при внешних воздействиях выступает критическим условием для успешного клинического исхода. Особенно это важно в областях, где регенерация тканей сопряжена с необходимостью агрессивной обработки зон повреждений с целью деконтаминации, например, при лечении периимплантита. Для чего используют антисептики и водно-воздушно-абразивные смеси на основе растворимых порошков. Антисептики, воздействуя на клеточные мембраны микроорганизмов, обеспечивают их разрушение. Однако за счет неспецифического действия они также могут влиять на эукариотические клетки, вызывая нарушение их целостности, внутриклеточного метаболизма и приводя к их гибели [1, 2]. Абразивные частицы, используемые для механического удаления биопленок, могут оказывать влияние на клетки не только за счет своего состава, но и за счет прямого механического воздействия и локального изменения осмотического давления [3, 4]

Несмотря на то, что антисептики и абразивы широко применяются в клинической практике, их сравнительное влияние на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) человека, как культурального аналога перицитов, остаётся недостаточно изученным. Практически отсутствуют исследования, позволяющие в рамках единой экспериментальной модели сопоставить цитотоксичность антисептиков и абразивов с учётом их дозозависимого и временного действия.

В связи с этим, целью исследования стала комплексная оценка in vitro влияния клинически применяемых антисептиков и абразивных агентов в различных концентрациях на жизнеспособность, морфологию и отсроченный ответ ММСК человека.

Цель

Провести комплексную in vitro оценку влияния применяемых в клинической практике антисептиков и абразивных агентов на жизнеспособность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани (ММСК ЖТ) человека для определения наиболее биосовместимых комбинаций, перспективных для применения в протоколах лечения периимплантита.

Материалы и Методы

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «Российский Национальный Исследовательский Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Все участники исследования до включения добровольно подписали форму информированного согласия.

Разведочное гистологическое исследование

 

Образцы тканей в виде имплантата с окружающими твёрдыми и мягкими тканями были получены от шести пациентов с диагнозом «периимплантит тяжелой степени тяжести» (N = 6; 2 мужчины и 4 женщины). Удаление дентальных имплантатов было произведено в связи с выраженной убылью костной ткани и невозможностью их использования для восстановления протетической части.

Мягкие ткани на этапе раскрытия имплантата получали с помощью скальпеля, после чего фиксировали в 10% забуференном формалине (Биовитрум, Россия) и передавали на гистологическое исследование с последующим изготовлением парафиновых срезов. Имплантаты с окружающей костью были удалены с помощью трепанов соответствующего размера различных марок и помещены в 10% формалин (Биовитрум, Россия), после чего переданы на гистологическое исследование с заливкой в твёрдый компаунд и изготовление гистологических шлифов.

Изготовление гистологических срезов

После обезвоживания в градиенте спиртов и ксилола образцы заключали в парафин по общепринятой методике. Далее изготавливали срезы толщиной̆ 5-10 мкм. Срезы окрашивали красителями: гематоксилином и эозином, по Ван Гизону и по Массону (Biovitrum, Россия).

Иммуногистохимическая окраска

Для выявления прогениторных клеток соединительной ткани применяли маркер CD146 (мышиные поликлональные антитела GTX18166, GeneTex, США) с системой визуализации на основе DAB (GTX73338, GeneTex, США) согласно протоколу производителя. Микрофотографии получали с помощью программно-аппаратного комплекса Carl Zeiss (Германия) на базе ZEN v3.0 и светового микроскопа Axioimager M.1.

 

Изготовление гистологических шлифов

Образцы с имплантатами и окружающей костью фиксировали в 10% формалине при температуре плюс 4°С в течение 7 дней. Затем образцы дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации. После этого образцы помещали в ацетон на сутки, после чего перекладывали в мономер этилметакрилата Technovit 4100 (Heraeus Kulzer, Германия) на двое суток. Далее образцы помещали в смесь метилметакрилата и бензоила пероксида и отправляли в термостат при температуре плюс 37°С для полимеризации заливочной среды. Шлифы толщиной 20-30 мкм изготавливали с помощью дисковой алмазной пилы Secotron 200 (Remet, Италия) и впоследствии шлифовали до толщины 25-50 мкм, после чего окрашивали гематоксилином и эозином.

Антисептики и абразивы

Для проведения исследования были использованы антисептические растворы, широко используемые в клинической практике: Хлоргексидин 0,05% (ЭСКОМ НПК, Россия), Мирамистин 0,01% (ИНФАМЕД К, Россия) и Октенисепт (Schulke & Mayr GmbH, Германия). В качестве контроля использовали Физиологический раствор (Панэко, Россия). Все жидкие антисептики исследовали в исходной концентрации, а также в разведениях в 2, 4 и 10 раз.

Среди абразивных средств изучали порошки, применяемые в воздушно-абразивных сиcтемах Air-Flow для снятия налета и проведения дезинфекции и полировки дентальных имплантатов: сода (EMS, Швейцария), эритритол (эритрол, EMS, Швейцария) и глицин (3M Deutschland GmbH, Германия). Растворы порошков 10% и 5% готовили в деионизированной воде (ПанЭко, Россия) и растворы порошков 2,5% и 1% готовили путем разведения 10% раствора в растворе Хенкса (ПанЭко, Россия) для имитации среды крови и предотвращения повреждения клеток из-за низкого осмотического давления среды. В качестве контроля использовали деионизированную воду и раствор Хенкса.

Клеточные культуры

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из подкожной жировой клетчатки человека были ранее получены и охарактеризованы [5]. Клетки культивировали в ростовой среде ДМЕМ/F12 (Панэко, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; PAA Laboratories, США), 0,584 мг/мл L-глутамина (Панэко, Россия), 5000 ед/мл пенициллина (Панэко, Россия) и 5000 мкг/мл стрептомицина (Панэко, Россия), 10 нг/мл rhFGF-2 (ProSpec, Израиль) и 5000 ед/мл гепарина натрия (B. Braun Medical Inc., Германия) при 37°С и 5% СО2.

Оценка цитотоксичности антисептиков

Для изучения цитотоксического действия антисептиков клетки снимали с подложки раствором 0,25% трипсина (ПанЭко, Россия) и Версена (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:1 в течение 5 мин при 37℃. Затем суспензию клеток центрифугировали при 1200 об/мин 5 мин, супентанант удаляли, а клетки высевали в 24-луночные планшеты (Nunс, Дания) в ростовой среде для проведения МТТ-теста или предварительно окрашивали PKH-26 согласно инструкции производителя (Sigma Aldrich, США) и высевали в 24-луночные планшеты в ростовой среде для дальнейшего окрашивания живых (Кальцеином АМ, Biotium, США) и мертвых клеток DAPI (ПанЭко, Россия). Через сутки, после прикрепления клеток, в лунки добавляли различные концентрации антисептиков, инкубировали клетки в течение 1 мин и удаляли среду с исследуемыми веществами. Половину планшетов анализировали сразу, а в другой части заменяли среду на ростовую и анализировали через 24 ч после инкубации с антисептиками.

Окрашивание клеток PKH-26

Витальное мечение клеток проводили с помощью мембранной флуоресцентной метки PKH 26 (red fluorescent cell linker kit, «Sigma»). Клетки снимали с подложки с помощью Версена и трипсина, центрифугировали 5мин 1100 об/мин. К клеточному осадку добавляли 250мкл растворителя С, ресуспендировали клетки и добавляли раствор РКН-26. Суспензию клеток перемешивали легким покачиванием и останавливали реакцию путем добавления эмбриональной телячьей сыворотки. Промывали раствором Хенкса с последующим центрифугированием 10мин 1100 об/мин.

МТТ-тест

По окончании эксперимента в лунки добавляли 0,5 мг/мл МТТ (ПанЭко, Россия) и инкубировали 2 ч при 37ºС. Затем кристаллы формазана элюировали из клеток с помощью ДМСО (ПанЭко, Россия, перемешивая на шейкере в течение 20 мин, и измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 570 нм и вычитая фоновое значение при 620 нм.

Флуоресцентная микроскопия живых и мертвых клеток

Клетки, предварительно меченные PKH-26 также окрашивали Кальцеином АМ в течение 35 мин при 37°С, затем добавляли раствор с DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) в концентрации 1 мкг/мл на 10 мин при 37°С. Клетки отмывали от красителей и фотографировали на флуоресцентном инвертированном микроскопе AxioObserver D1 с камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия). При флуоресцентной микроскопии PKH-26 окрашивал в красный цвет мембраны клеток, Кальцеин АМ – зелёным цитоплазму живых клеток с неповреждённой мембраной, а DAPI – синим цветом ядра мёртвых клеток.

Статистический анализ

Для статистического анализа полученный данных применяли программное обеспечение GraphPad Prism v10 (США).

Отклонение характера распределения от нормального оценивали с помощью критерия Д’Агостино-Писрона. Поскольку распределение исследуемых параметров приближалось к нормальному на каждом сроке наблюдения для выявления межгрупповых различий применяли однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением критерия Шидака. Для сравнения групп с контрольным значением на этапе лабораторных исследований использовали тест Данна. Для сравнения двух групп использовали t-критерий Стьюдента. На столбчатых диаграммах в виде высоты столбца применяли арифметическое среднее (µ) и в виде усов — стандартное отклонение (SD). Различия считали статистически значимыми при уровне статистической значимости равной 5% (α = 0,05) или уровне ошибки отклонения от нулевой гипотезы ниже 5% (p < 0,05). Число независимых экспериментов — 3, число технических повторов в каждом — 3.

Результаты

Структурные изменения тканей по данным гистологического исследования биопсийного материала

При исследовании мягких тканей, иссечённых в области периимплантного кармана, выявляли типичные признаки воспаления. Периимплантные мягкие ткани прежде всего были представлены грануляционной тканью, в которой наблюдали полнокровные сосуды, повреждённые коллагеновые волокна с инфильтрацией иммунных клеток: лимфоцитов, плазмоцитов, лейкоцитов и макрофагов, что говорит о непрерывной стадийности воспалительного процесса и повреждения межклеточного матрикса. Иммуногистохимическое окрашивание на CD146 выявило усиленную миграцию прогениторных клеток, что указывало на активизацию регенераторных процессов в зоне поражения (рис.1). Полученные данные подтверждают клиническую значимость сохранения жизнеспособности ММСК при проведении деконтаминации.

 

Цитотоксичность антисептиков

 

В контрольной группе с использованием физиологического раствора цитотоксического эффекта не наблюдалось. Клетки прикреплялись к культуральному пластику, сохраняли жизнеспособность и целостность клеточной мембраны, что было подтверждено флуоресцентной микроскопией и МТТ-тестом (рис.2). Исследуемые антисептики демонстрировали дозозависимую цитотоксичность по отношению к ММСК ЖТ (рис. 3).

Мирамистин показал наименьшую цитотоксичность среди исследуемых антисептиков. Выраженными цитосовместимыми свойствами обладал раствор антисептика, разбавленного в 10 раз. Относительная выживаемость клеток составила 96,21±9,4%, в то время как неразведенный раствор 0,01% снижал её до 18,8 ± 4,3% (рис.4). При оценке отсроченной цитотоксичности через 24 часа после отмывки клеток и инкубации в питательной среде относительная выживаемость клеток незначительно снизилась по сравнению с немедленным воздействием. При исходной концентрации жизнеспособность клеток составила 15,9 ± 3,7%, при двукратном разведении она возросла в 2,8 раза, при десятикратном – в 5 раз по сравнению с неразведенным раствором (рис.3).

Хлоргексидин в исходной концентрации 0,05% демонстрировал значительную цитотоксичность – жизнеспособность клеток составляла 3,2 ± 0,4%. Десятикратное разведение раствора приводило к повышению показателя относительной выживаемости клеток в 16 раз. При оценке отсроченной цитотоксичности разведенный в 10 раз раствор Хлоргексидина вызвал значительное снижение жизнеспособности клеток до 44%. При других разведениях также наблюдался значительный цитотоксический эффект: неразведенный раствор снижал жизнеспособность до 2,7 ± 0,29 %, разведение в два раза — до 7,26 ± 0,77 %, разведение в четыре раза — до 16,2 ± 0,29% (рис. 5).

Октенисепт вызывал наиболее выраженную гибель клеток среди всех исследованных антисептиков. В неразведенном виде и при разведениях в 2,4 и 10 раз жизнеспособность клеток не превышала 25%. Раствор октенисепта в исходной концентрации приводил к фиксации клеток на подложке, что визуализировалось при окрашивании DAPI (рис.6). Оценка отсроченной цитотоксичности октенисепта показала практически полную гибель клеток при всех исследованных концентрациях, включая разведение в 10 раз, где жизнеспособность составила 17,5 ± 1,79 % (рис. 3).

Таким образом, сравнительный анализ цитотоксических свойств антисептических растворов показал, что Мирамистин обладает наиболее выраженными цитосовместимыми свойствами (рис. 3). Хлоргексидин демонстрировал острую цитотоксичность, которая частично снижалась при его разведении. Однако при отсроченном наблюдении раствор также характеризовался высокой цитотоксичностью, которая указывает на необратимость повреждения клеток при обработке антисептиком. Октенисепт характеризовался наиболее агрессивным воздействием на клетки, вызывая немедленную массивную клеточную гибель даже при значительном разведении.

 

Цитотоксичность абразивных агентов

 

В контрольных группах деионизированная вода и раствор Хэнкса не оказывали цитотоксического действия (рис. 7). Абразивные агенты демонстрировали дозозависимую цитотоксичность, однако с различным профилем немедленного и отсроченного эффекта (рис.8).

Растворы соды сразу после экспозиции приводили к незначительному снижению жизнеспособности ММСК ЖТ человека примерно до 80%. При оценке через 24 часа сода в большинстве разведений обладала низкой цитотоксичностью, за исключением исходной концентрации, при использовании которой относительная выживаемость составляла 67 ± 5%, что соответствует умеренной цитотоксичности (рис.9). Для растворов эритритола и глицина отмечалось дозозависимое снижение жизнеспособности клеток сразу после экспозиции с абразивами (рис.10, 11). Оценка немедленной и отсроченной цитотоксичности глицина в разведениях 1x и 2x показало наличие низких цитотоксических свойств. В то время как разведения в 4x и 10 x раз не оказывали отрицательного влияния на клетки ни на одном из сроков наблюдения. Эритритол вызывал наиболее выраженный токсический эффект среди абразивов. Сразу после инкубации с исходным и разведенным в 2 раза абразивом, относительная цитосовместимость клеток составляла не более 20%. Разведение в 4х и 10х раз способствовало повышению жизнеспособности клеток до 63,9±1% и 102 ± 2% соответственно. Через 24 часа цитотоксический эффект усиливался. Относительная выживаемость клеток при использовании разведенного в 10 раз абразива составила 73,1 ± 2,1%, в 4 раза – 26,6 ± 0,7%; при разведениях 1x и 2x наблюдалась значительная клеточная гибель (рис. 10)

Таким образом, глицин продемонстрировал цитосовместимость, особенно при 4х и 10х-кратном разведении. Сода вызывала умеренное, преимущественно обратимое снижение жизнеспособности клеток Эритритол характеризовался наиболее выраженным и труднообратимым цитотоксическим действием на ММСК ЖТ (рис.11).

Обсуждение

Сравнительная оценка цитотоксичности антисептиков показала различия между ними. Мирамистин продемонстрировал наименьший уровень токсичности, что объясняется его механизмом действия: препарат встраивается в гидрофобные области клеточных мембран и нарушает осмотический баланс бактерий, тогда как в терапевтических концентрациях его мишени в мембранах эукариотических клеток менее доступны [6]. Такая избирательность выгодно отличает Мирамистин от Хлоргексидина, который неспецифически взаимодействует с фосфолипидами клеточных мембран, что обусловливает его токсичность для широкого спектра клеток. Полученные нами данные об отсроченном цитотоксическом эффекте Хлоргексидина согласуются с представлениями о способности препарата проникать в цитоплазму и необратимо нарушать клеточный метаболизм даже после однократной кратковременной экспозиции [2].

Октенисепт проявлял наиболее выраженную и необратимую цитотоксичность, включая фиксацию клеток при использовании неразведённого раствора. Вероятно, это связано с синергизмом двух активных компонентов препарата — октенидина дигидрохлорида и фенокситанола, каждый из которых способен самостоятельно нарушать целостность клеточных мембран. Эти результаты согласуются с выводами другого исследования, где было продемонстрировано, что Октенисепт может негативно влиять на пролиферацию прогениторных клеток, полученных из жировой ткани [7].

Глицин и сода демонстрировали значительно более высокую биосовместимость. Отсутствие токсичности глицина при невысоких концентрациях также показано в других исследованиях, что связано с его аминокислотной природой [8]. При оценке непосредственной цитотоксичности растворы соды (бикарбоната натрия) в концентрациях от 2% до 5% (разбавления 4х и 10х) не оказывали выраженного цитотоксического эффекта, что согласуется с результатами другого исследования, где это было показано на зрелых фибробластах десны [3].

Иммуногистохимическое исследование материала пациентов с периимплантитом подтвердило активную миграцию прогениторных клеток в очаг поражения. В этом контексте оценка цитотоксического воздействия именно на ММСК является важным аспектом работы, поскольку сохранение жизнеспособности прогениторных клеток соединительной ткани во время лечения периимплантита методом деконтаминации является важным условием последующей остеоинтеграции и восстановления контура мягких тканей.

Заключение

В результате проведенного исследования впервые была проведена комплексная оценка немедленного и отсроченного действия антисептиков (Мирамистин, Хлоргексидин, Октенисепт) и абразивов (Сода, Глицин, Эритритол) на жизнеспособность клеток ММСК-ЖТ человека в широком диапазоне концентраций. Исследованные вещества обладали дозозависимой цитотоксичностью. Однако степень её выраженности имела принципиальные различия. Среди антисептиков наиболее щадящим действием обладал Мирамистин при его 10-кратном разведении, в то время как Октенисепт вызывал необратимые повреждения и гибель клеток. Среди абразивов высокой цитосовместимостью обладали глицин и сода, а эритритол характеризовался значительной цитотоксичностью. Результаты работы демонстрируют, что сочетание Мирамистина и соды является наиболее перспективным с точки зрения влияния на прогениторные клетки. Применение Октенисепта и эритритола в клинически значимых концентрациях сопровождается выраженным цитотоксическим эффектом, что может нивелировать регенераторный потенциал тканей после хирургического вмешательства. Полученные данные вносят вклад в понимание биологической совместимости абразивов и антисептиков и определяют перспективы дальнейшего изучения их влияния на остеогенную дифференцировку ММСК и верификацию полученных результатов в доклинических и клинических условиях.

About the authors

Elena B. Strandstrem

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: 2336362@mail.ru

applicant for the degree of candidate of medical sciences of the Department of therapeutic Stomatology «N.I. Pirogov Russian National Research Medical University» 117997, Moscow, Russian Federation

117997, Moscow, Ostrovitianova St, 1

Valeriya Sergeevna Kuznetsova

Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery; Research Centre for Medical Genetics

Author for correspondence.
Email: tilia7@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8643-1642

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела по работе с грантами

Russian Federation, 119021, Moscow, Timura Frunze 16; Moskvorechye St 1, Moscow, 115522, Russian Federation

Irina A. Nedorubova

Research Centre for Medical Genetics

Email: nedorubova.ia@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8472-7116
SPIN-code: 1548-6998
Russian Federation, Moskvorechye St 1, Moscow, 115522, Russian Federation

Tatiana B. Bukharova

Research Centre for Medical Genetics

Email: bukharova-rmt@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0481-256X
SPIN-code: 2092-5580

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moskvorechye St 1, Moscow, 115522, Russian Federation

Igor I. Babichenko

Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery; Peoples’ Friendship University of Russia

Email: babichenko@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-5512-6813
SPIN-code: 2651-8409

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, 16 Timur Frunze street, 119021 Moscow; 117198, Moscow, Miklukho-Maklaya str.6

Igor S. Kopetsky

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: kopetski@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-4723-6067
SPIN-code: 8813-9525

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, 1 Ostrovityanova street, 117997, Moscow

Andrey V. Vasilyev

Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery; Research Centre for Medical Genetics

Email: vav-stom@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7169-2724
SPIN-code: 8864-6279

MD, Dr. Sci. (Medicine), Associate Professor

Russian Federation, 16 Timura Frunze street, 119021 Moscow; Moskvorechye St 1, Moscow, 115522, Russian Federation

References

Supplementary files