Identification of Major Histocompatibility Complex Class I Ligands in Ovarian Adenocarcinomas



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

BACKGROUND. Ovarian adenocarcinoma is characterized by a high mortality rate due to late diagnosis and the development of resistance to standard chemotherapy. Despite the introduction of targeted therapies, the risk of recurrence remains high, highlighting the need for new therapeutic approaches. In this view, immunotherapy is a promising approach, but requires the identification of specific tumor antigens.

AIM. To identify tumor antigens in ovarian adenocarcinoma that are promising for immunotherapy.

METHODS. Immunopeptidome from cell lines and postoperative material of patients with ovarian adenocarcinoma were isolated using immunoaffinity chromatography followed by liquid chromatography-mass spectrometry analysis.

RESULTS. In this study, we tested an affinity chromatography-based immunopeptidome isolation protocol, comparing various detergents (CHAPS, NP-40, SOD, and Triton X-100) for cell lysis, and observed no statistically significant differences in the number of identified peptides. Using NP-40, 5 peptides belonging to the proteins of cancer/testis antigens (CTA) were identified in the immunopeptidomes of postoperative material from patients with ovarian adenocarcinoma, 3 of which, according to the human protein atlas, are indeed not expressed in normal ovarian tissues.

CONCLUSION. Each of the four tested detergents provides identification of unique sets of peptides. Immunopeptidome analysis allows the identification of peptides of CTA proteins, but a larger sample of postoperative material from patients with ovarian adenocarcinoma and experimental testing of the immunogenicity of the identified peptides are needed for further research.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Аденокарцинома яичника занимает первое место по смертности среди других гинекологических злокачественных новообразований. В связи с отсутствием явных симптомов на начальных этапах заболевания более чем в 85% случаев опухоль яичника диагностируют только на поздних стадиях (III или IV) [1]. Лечение аденокарциномы яичника на поздних стадиях могут осуществлять с помощью первичной циторедуктивной хирургии с последующим курсом адъювантной химиотерапии (карбоплатин и паклитаксел) или неоадъювантной химиотерапии с последующей циторедуктивной хирургией и адъювантной химиотерапией. Опухоли первоначально реагируют на лечение, но в процессе терапии постепенно приобретают лекарственную устойчивость, из-за чего рецидивы встречаются у 80% пациентов с аденокарциномой яичника в течение 6-12 месяцев после окончания химиотерапии [2]. При этом химиотерапия первой линии (в том числе неоадъювантная химиотерапия), используемая при аденокарциноме яичника, в течение последних 10 лет осталась неизменной [3]. 

Только недавно в качестве поддерживающей терапии были одобрены таргетные подходы к терапии, такие как ингибиторы поли(АДФ-рибозы)-полимеразы (PARPi) и бевацизумаб (моноклональное антитело, блокирующее ангиогенез), что облегчило лечение рецидивов аденокарциномы яичника. Тем не менее, пятилетняя выживаемость находится в диапазоне 10 - 40 %, и у 75% пациенток с поздней стадией заболевания в течение 2 лет наблюдается рецидив аденокарциномы яичника [4]. Это подчеркивает необходимость в обеспечении арсенала эффективных препаратов и разных терапевтических схем, предотвращающих развитие устойчивости, и, следовательно, рецидива болезни.

            Иммунотерапия произвела революцию и лечении злокачественных опухолей и продолжает бурно развиваться, что выражается как в появлении новых подходов, так и к поиску новых молекулярных мишеней. Среди последних особое внимание уделяют пептидам, презентируемым в комплексе с человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA, Human Leukocyte Antigens) I класса на поверхности опухолевых клеток. Молекулы HLA I представляют собой мембранные белковые комплексы, ассоциированные с короткими пептидами. Такие комплексы пептид-HLA (pHLA) взаимодействуют с Т-клеточными рецепторами, что является одним из ключевых событий при развитии адаптивного иммунного ответа. Связанные с HLA I пептиды – иммунопептидом – образуются в результате протеасомальной деградации внутриклеточных белков. Образующиеся неоантигены, измененные формы белков опухолевых клеток, могут иметь отражение в иммунопептидоме, поэтому информацию о репертуаре иммунопептидома используют для создания персонализированных противоопухолевых вакцин [5].

Традиционно аденокарцинома яичника не считается чувствительной к иммунотерапии, однако все больше данных указывает на то, что эта опухоль на самом деле является иммуногенной [6]. Большинство клинических испытаний иммунотерапии аденокарциномы яичника основывались на опухоль-ассоциированных антигенах, таких как Her2neu, WT1, NY-ESO-1 и p53. При этом идентификацию и количественный анализ пептидных фрагментов этих белков в комплексе с HLA I на поверхности клеток аденокарциномы яичника не проводили, что служит основным недостатком этих исследований. Таким образом, крайне важно глубокое изучение HLA-I-представленного антигенного профиля опухолей яичника, чему посвящены последние исследования [7–9].

В этой работе мы оптимизировали протокол выделения иммунопептидома на клеточной линии Jurkat, тестируя различные детергенты (CHAPS, NP-40, SOD и Triton X-100) для максимизации идентификации пептидов-лигандов HLA I, и применили его для анализа постоперационного материала аденокарциномы яичника до химиотерапии (n = 1) и после (n = 3) с целью поиска пептидов опухоль-тестикулярных антигенов (CTA, Cancer/Testis Antigens).

ЦЕЛЬ

Идентифицировать опухоль-тестикулярные антигены в аденокарциноме яичника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Используемые клеточные линии и опухоли

Клеточные линии. В работе использовали клеточную линию Jurkat (ATCC, TIB-152), K562 (ATCC, CCL-243) и клеточную линию гибридомы HB-95 (ATCC, продуцент w6/32 антител). Клеточные линии Jurkat и K-562 культивировали в среде  RPMI 1640 (ПанЭко, С330п) 10 % FBS (Gibco 26140079), 50 ед./мл гентамицин (ОАО “Дальхимфарм”), 1,6 мМ глутамин (GlutaMAX, Gibco 35050061). Все клеточные линии культивировали до необходимого количества, после чего центрифугировали 5 мин при 150 g (Eppendorf 5804 R), клеточный осадок промывали трижды фосфатным раствором Дульбекко pH 7,4 (ПанЭко, Россия), отбирали супернатант и хранили клеточный осадок при -80℃ до проведения дальнейших экспериментов. 

Для получения антител к HLA I культивировали клеточную культуры гибридомы HB 95 (продуцент HLA-ABC w6/32 антител, ATCC). Первичную культивацию осуществляли в среде DMEM F12 Advanced (Gibco, 12634010) с добавлением 10% FBS (инактивация при 56℃ 30 минут), 50 ед./мл гентамицина, 1,6 мМ глутамина. При достижении плотности 600 тыс клеток/мл, меняли среду на содержащую вдвое меньше FBS. Таким образом, постепенно снижали концентрацию FBS в среде. По достижению концентрации FBS 0,5%, среду заменяли на HyClone ADCF-mab (cytiva), 50 ед./мл гентамицин, 1,6 мМ глутамин. В этой среде культивировали до гибели 80-90% клеток, затем отбирали супернатант, содержащий антитела. Концентрацию антител в клеточной среде измеряли коммерческим набором Easy-Titer mouse IgG Assay (Thermo Scientific, 23300) в соответствии с рекомендациями производителя.

Все клетки регулярно тестировали на наличие микоплазменного заражения и культивировали при температуре 37°C и 5% CO2.

Пациенты. В работе использовали образцы опухолевой ткани аденокарциномы яичника пациентов, прошедших химиотерапевтическое лечение с применением препаратов таксанов и карбоплатина (n = 3, пациенты 1-3) и без предварительного лечения (n = 1, пациент 4). Образцы были получены из Российского научного центра рентгенорадиологии (Москва, Россия). Диагнозы были подтверждены морфологическими заключениями. Исследование было одобрено этическим комитетом Российского научного центра рентгенорадиологии (соглашение и протокол № 30-2018/Е от 13 ноября 2018 г.). Все пациенты предоставили письменное согласие на участие.

Иммуногистохимическое окрашивание

Образец опухолевой ткани массой 2 - 4 г препарировали с целью удаления жировой ткани, остатков сосудистой системы, стромы в фосфатно-солевым буфере (PBS) с добавлением ингибиторов протеаз (ProteaseInhibitor Cocktail X100, Thermo Scientific). Фрагменты ткани осушали при помощи фильтровальной бумаги и помещали в цилиндрические формы, наполненные средой для заморозки (Erpedia Cryomatrix, Frozen EmbeddingResin), которые замораживали в парах жидкого азота, после чего делали срезы толщиной 5 - 7 мкм на криотоме (Thermo Shandon Cryotome FSE Cryostat Microtome) при температуре -25℃. Полученные срезы иммобилизировали на полилизиновых стеклах и замораживали на -80℃ до проведения иммуногистохимии.

Иммобилизованные на полилизиновых стеклах срезы промывали PBS в течение 15 минут. Затем фиксировали при помощи 4% параформальдегида на протяжении 30 минут при комнатной температуре с последующей промывкой в PBS. Затем пермеабилизировали клеточные мембраны ткани при помощи 0,1% раствора Triton X-100 в PBS при комнатной температуре в течение 30 минут с последующей промывкой в PBS. Промытые срезы инкубировали в растворе первичных анти-CA125 (CA125/MUC16 Antibody, Novus Biologicals, CL2783) и анти-HLA I (HLA-ABC Monoclonal Antibody (W6/32), Functional GradeInvitrogen MA1-80123) антител в разведении 1:200 в PBS с 0,1% tween-20 (v/v) (PBST), содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (BovineSerum Albumin, BSA), (Sigma-Aldrich, США) в течение 12 часов при +4℃ во влажной камере. Первично окрашенные срезы промывали раствором PBS, а затем инкубировали в растворе вторичных антител (Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, A-21137) в разведении 1:400 в PBST , содержащем 1% BSA в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. По окончании инкубации промывали в PBS, затем препараты инкубировали в течение 30 минут с 4',6-диамино-2-фенилиндол гидрохлоридом (DAPI, Sigma-Aldrich, В 9542-5MG ) в концентрации 0,1 мкг/мл в PBS для визуализации ядер; отмывали 2 раза PBS. Полученные препараты исследовали под флуоресцентным микроскопом Eclipse Ni-E(Nikon, Япония).

Подготовка лизатов клеточных линий и тканей

При работе с клеточными линиями к сухому клеточному осадку добавляли 5 мл лизирующего буфера (150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, ингибиторы протеаз Protease Inhibitor Cocktail X100 (Thermo Scientific), детергент (Таблица 1)) и инкубировали на 1 час на мультиротаторе (BioSan Multi-Bio RS-24) при 4°С. Концентрацию детергентов подбирали в соответствии с используемыми в литературе [10–12], но не менее двукратной критической концентрации мицеллообразования (CMC, Critical Micelle Concentration). Клеточный лизат обрабатывали ультразвуком (Elma S30H), затем центрифугировали 15 минут при 14 000 g (Eppendorf 5804 R, ротор А-4-44) и отбирали супернатант.

Таблица 1. Детергенты для лизиса клеток

Детергент

Тип детергента

СМСх2, ммоль/л

Mr детергента, г/моль

Конечная концентрация детергента

NP-40 (Igepal CA-630)

неионный

0,166-0,176

603

1 %

CHAPS

цвиттер-ионный

12-20

615

1 %

SOD

анионный

4-12

414,55

0,25 %

Triton X-100

неионный

0,4-1,8

625

1 %

 

Образец опухолевой ткани массой 0,2 г гомогенизировали керамическими сферами (MagNA Lyser GreenBeads, Roche) в 1 мл лизирующего буфера (150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl , ингибиторы протеаз Protease InhibitorCocktail X100, 1 % NP-40) при помощи автоматического гомогенизатора (MagNA Lyser, Roche) при 7000 g cпериодическим охлаждением образцов. Гомогенат ткани вместе с керамическими сферами переносили в лизирующий буфер объемом 4 мл и оставляли на мультиротаторе (BioSan Multi-Bio RS-24) на 1 час при 4°С. Полученный лизат ткани предварительно обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут (ультразвуковая баня Elma S30H), центрифугировали 15 минут при 14 000 g (Eppendorf 5804 R, ротор А-4-44) и отбирали супернатант.

Иммунопреципитация pHLA I

Для выделения использовали 1 мл суспензии агарозной смолы Pierce Protein A/G Agarose (Thermo Fisher) помещали в колонку для хроматографии низкого давления (Econo-Column 0.5x5 cm, Bio-Rad). Смолу промывали 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4), затем наносили на колонку клеточную среду, полученную после культивации гибридомы HB-95 в расчете 2 мг антител на 1 мл смолы. Клеточную среду перед нанесением разбавляли PBS в соотношении 1:1. Колонку промывали 5 мл раствора 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, после чего вносили лизат и инкубировали 2.5 часа, зациклив хроматографическую систему. Затем колонку последовательно промывали 50 мл PBS, 5 мл 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, 10 мл mQ и элюировали 10 мл. Комплексы pHLA I и антитела элюировали 10% раствором уксусной кислотой. По окончании работы с колонкой промывали ее раствором 50 мл PBS, затем консервировали ее в PBS с 0,02% NaN3.

Элюат концентрировали при помощи центрифужного вакуумного испарителя (Concentrator plus, Eppendorf) при 60°С в течение 4,5 часов до 100 - 200 мкл. Сконцентрированный элюат разбавляли раствором 3% ацетонитрила 0,1% TFA до 500 мкл и обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут (ультразвуковая баня ElmaS30H). Затем пептиды отделяли от HLA комплексов, используя картриджи для центрифужного фильтрования (Vivaspin 500, 10 kDa) в соответствии с протоколом производителя. Картриджи дополнительно промывали картриджи 300 мкл 3% ацетонитрила 0,1% TFA дважды. Пептиды высушивали в вакуумном испарителе (Concentrator plus, Eppendorf) при 60°С в течение 6 часов и хранили при -80 C до хромато-масс-спектрометрического анализа.

Хромато-масс-спектрометрический анализ лигандов HLA I

Пептиды перед масс спектрометрическим анализом растворяли в 15 мкл 3% ацетонитрила в 0,1% TFA. Масс-спектрометрический анализ был выполнен на масс-спектрометре Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-OrbitrapMass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Хроматографическую систему собирали по схеме предколонка-колонка (колонка: сорбент – Aeris Peptide XB-C18 (Agilent, США), длина – 15 см, внутренний диаметр – 75 мкм, размер частиц – 3 мкм, диаметр пор – 120 А, предколонка: сорбент - Aeris Peptide XB-C18, (Agilent, США), длина – 1 см, внутренний диаметр – 100 мкм, размер частиц – 3 мкм, диаметр пор – 120 А, растворитель A – 98,9% H2O, 1% MeOH, 0,1% муравьиная кислота; растворитель B – 99,9% ACN, 0,1% муравьиная кислота), хроматографические колонки термостатировали при 50°С.

На предколонке нанесение и промывку проводили в течение 10 минут при скорости потока 2 мкл/мин растворителя A. Разделение проводили при 300 нл/мин, градиент: 1 мин – 95% растворителя A, 5% растворителя B; затем в течение 120 минут линейно увеличивали содержание ацетонитрила до 60% растворителя А, 40% растворителя B. После этого промывали хроматографическую систему в течение 10 минут 95% растворителя B, затем в течение 17 минут промывали 95% растворителя A и 5% растворителя B.

Режим измерения масс-спектров: время накопления масс-спектров – 250 мс, диапазон соотношений масса/заряд от 300 до 1250 m/z, критерии для предпочтительного отбора ионов для изоляции и фрагментации – заряд 2-5, число родительских ионов, отбираемых в каждом цикле – не более 50, минимальная интенсивность 100 отсчётов/с. После первого анализа ион принудительно исключался из списка ионов для фрагментации на 15 с. Параметры фрагментации: время накопления спектров фрагментации – 100 мс, диапазон соотношений масса/заряд от 100 до 2000 Th, напряжение в ячейке соударений изменялось линейно от 25 В до 55 В, время полного цикла – не более 5,3 с.

Анализ масс-спектрометрических данных

Исходные масс-спектрометрические данные конвертировали в масс-листы формата MGF (Mascot GenericFormat) при помощи программы msconvert (ProteoWizard). Идентификацию пептидов проводили при помощи программ MASCOT и X!Tandem против базы данных белков UniProt Knowledgebase, таксон Homo sapiens. Результаты идентификаций объединяли в программе Scaffold. Среди идентифицированных пептидов (FDR < 0,05) отбирали пептиды длиной 8-14 а.к.о. и предсказывали аффинность пептидов к соответствующим аллотипам HLAI (Таблица 2) с помощью NetMHCpan 4.1[13]. Пациенты, чей опухолевый материал исследовали в работе, не были типированы по HLA I, поэтому аффинность пептидов, идентифицированных в опухолевых образцах, предсказывали к наиболее распространенным аллотипам HLA I (A01:01, A02:01, 03:01, A24:02, A26:01, B07:02, B08:01, B27:05, B39:01, B40:01, B58:01, B15:01). Пептиды с рангом < 0,5 считали высокоаффинными, а с рангом от 0,5 до 2 – слабоаффинными. Для сравнения количества идентифицированных аффинных пептидов использовали генерализованную линейную модель (GLM, generalized linear model). 

Таблица 2. Используемые клеточные линии и соответствующие аллотипы HLA I.

Клеточная линия

Аллотипы HLA I

Jurkat

A03:01, B07:02, B35:01, C04:01, C07:01

K-562

A11:01, A37:01, B18:01, B40:01, C50:01, C03:04, C05:01

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение детергента для выделения иммунопептидома

Протоколы пробоподготовки при определении комплексов пептид-HLA (pHLA) не стандартизированы [14] и в настоящее время считаются “ахиллесовой пятой” иммунопептидомики [15]. При этом количество идентификаций отличается при варьировании условий выделения, в том числе отличия наблюдаются между лабораториями [16]. Мы тестировали 4 детергента (Таблица 1, материалы и методы), каждый использовали в концентрации, не менее двукратной концентрации критического мицеллообразования (CMC; Critical Micelle Concentration) [16]. Выделили иммунопептидом из 150 млн клеток линии Jurkat, используя иммуноаффинную хроматографию на 1 мл агарозной смолы protein A/Gи 2 мг антител w6/32 в четырех независимых биоповторах для каждого детергента. Разные биоповторы выделяли в различные дни. В качестве отрицательного контроля для выделения использовали клеточную линию К-562, дефектную по экспрессии HLA I [17]. Суммарно, используя различные детергенты, идентифицировали 6891 пептид в клеточной линии Jurkat, 35,4% из которых характеризовались аффинностью к соответствующим аллелям HLA I (1753 высокоаффинных и 690 низкоаффинных пептидов). Из 2443 идентифицированных аффинных пептидов 188 (7,7%) были общие для всех детергентов, при этом наибольшее число уникальных пептидов среди всех выделений было получено при использовании CHAPS (Рис.1A). Наибольшее количество идентификаций аффинных к HLA I пептидов также наблюдали после лизиса с использованием CHAPS (1333 пептидов), в то время как лизисы с использованием TritonX-100, SOD или NP-40 продемонстрировали схожие между собой результаты: 938, 912 и 785 пептидов, соответственно (Рис.1А). При этом наблюдали отличия в количестве идентификаций между разными запусками MS/MS анализа (Рис.1Б). В частности, в результате третьего запуска идентифицировали больше пептидов, чем в остальных запусках (GLM, p-value < 0,05). Однако статистических отличий в количестве идентифицированных пептидов при использовании разных детергентов не наблюдали. Однако в клеточной линии K-562 идентифицировали меньше аффинных к HLA пептидов (GLM, p-value < 0,05); 3,5% из всех идентифицированных пептидов характеризовались высокой аффинностью к HLA I и 8% были низкоаффинными (Рис.1В).

 

Рис.1. А – Количества и перекрытие идентифицированных аффинных к HLA I пептидов с использованием разных детергентов для лизиса; Б – Количество идентификаций пептидов в каждом отдельном запуске MS/MS; В – Распределение длин идентифицированных пептидов при выделении лигандов HLA I из 150 млн клеток Jurkat и K562; Г – распределение аминокислотных остатков в 9-членных пептидах, идентифицированных в клеточных линий Jurkat и K-562, n – количество пептидов, использованных для составления лого. Вертикальная ось (Bits) – степень консервативности в определенной позиции; ось X – позиция аминокислоты в пептиде.

Пик распределения длины пептидов соответствовал 9 а.к.о. – длине наиболее частых лигандов HLA I(Рис.1В). Известно, репертуар идентифицируемых иммунопептидов зависит от метода их выделения и очистки, причем каждый метод дает уникальный набор пептидов [16]. Мы сравнили распределения длин аффинных к HLAI пептидов и наблюдали отличия везде, за исключением пар TritonX-100 – CHAPS и NP-40 – SOD (U-критерий, adj. p-value > 0,05), при этом распределения отличались от “иммунопептидома” клеточной линии K-562 (adj. p-value < 0,05). Помимо характерного распределения длин, лиганды HLA I характеризуются якорными а.к.о., обеспечивающими взаимодействие с HLA I. В случае 9-членных пептидов, такие а.к.о., как правило, находятся во 2 и 9 положениях. В соответствии с этим, среди идентифицированных аффинных к HLA пептидов длиной 9 а.к.о. наблюдали консервативные позиции во 2 и 9 положениях (Рис.1Г). Во втором положении чаще других а.к.о. наблюдали лейцин, пролин, валин, изолейцин, а в девятом – лизин, лейцин и аргинин.

Таким образом, при использовании каждого детергента наблюдали характерную для иммунопептидома картину, а именно: характерный пик распределения длины  пептидов при  9 а.к.о., высокий процент аффинных к HLA I пептидов и специфический паттерн аминокислотных остатков на N- и C-конце пептида. Аналогичный анализ для клеточной линии K-562 не выявил таких особенностей.

Иммунопептидом аденокарциномы яичника

Анализ иммунопептидома представляет наибольший интерес в клинике для поиска аутоантигенов [18], мишеней для терапии инфекционных заболеваний [19, 20] и иммунотерапии опухолей [21–23]. Отработав методику иммунопреципитации pHLA I на клеточных линиях, провели анализ трех образцов постоперационного материала пациентов с аденокарциномой яичника. Образцы опухоли были охарактеризованы иммуногистохимическим окрашиванием 2 белковых маркеров аденокарциномы яичника: EpCAM, сверхпредставленный в карциномах яичника [24], и CA125 [25], а также HLA I на поверхности клеток (Рис. 2А). В результате анализа иммунопептидома идентифицировали 2671 уникальный пептид, 1364 (51%) из которых имели аффинность к распространенным аллелям HLA I. Распределение длин аффинных к HLA I пептидов в каждом образце имело характерный для иммунопептидома пик на 9 а.к.о. (Рис.2Б), якорные а.к.о. 9-членных пептидов находились во 2 и 9 положениях (Рис.2В).

 

Рис.2. А – иммуногистохимическое окрашивание срезов аденокарциномы яичника; Б – Распределение длин и аффиностей к HLA I идентифицированных в опухолевых образцах пептидов; В –  распределение аминокислотных остатков в 9-членных пептидах, идентифицированных в иммунопептидомах аденокарциномы яичника. Вертикальная ось (Bits) – степень консервативности в определенной позиции; ось X – позиция аминокислоты в пептиде

CTA рассматриваются в качестве перспективных маркеров и мишеней для иммунотерапии. В норме экспрессия CTA ограничена мужскими половыми клетками и плацентой, однако опухоли часто также начинают их экспрессировать, в том числе аденокарцинома яичника, что делает эти антигены привлекательными для диагностики и таргетной терапии [26–28]. Исходя из этого, среди идентифицированных пептидов искали те, которые относятся к белковым продуктам CTA из базы данных CTdatabase (http://www.cta.lncc.br/). Идентифицировали пять таких пептидов (Таблица 3), при этом также идентифицировали три пептида, относящихся к маркеру рака яичника CA125 (MUC16) – LALDTSTLET и QPLHAVSSEKV, TVLPEVPG.

ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе мы провели сравнительный анализ детергентов, применяемых для лизиса клеток при выделении иммунопептидома, с целью выбора наиболее эффективного. Хотя статистически значимых различий в общем количестве идентифицированных пептидов обнаружено не было, мы наблюдали различия в распределении длин пептидов. Это подтверждает, что каждый детергент способствует выделению уникального репертуара пептидов [16]. При этом 188 (7,7%) общих пептидов удалось выделить с применением каждого из детергентов, однако количество общих пептидов может быть повышено до 42% [16], вероятно, за счет увеличения глубины анализа и количества идентификаций. Идентифицированные нами паттерны якорных аминокислотных остатков в иммунопептидоме клеточной линии Jurkat согласуются с ранее представленными результатами анализов пептидов-лигандов HLA I клеточной линии Jurkat [29–31]. Помимо этого, среди идентифицированных пептидов в “иммунопептидоме” клеточной линии K-562  11,5% пептидов характеризовались аффинностью к HLA I. Специфичность NetMHCpan 4.0 при использовании 2% перцентиля в качестве критического значения для оценки аффинности составляет 98,5% [32], однако мы считали пептид лигандом, если он аффинен хотя бы к одному из 7 анализируемых HLA аллелей клеточной линии K-562 (A11:01, A37:01, B18:01, B40:01, C50:01, C03:04, C05:01), поэтому вероятность ошибки оценивается в 10%, что может объяснить количество наблюдаемых аффинных лигандов K-562. В совокупности, наши результаты подтверждают надежность идентифицированных нами пептидов при использовании каждого детергента. При этом, несмотря на то, что наибольшее число пептидов идентифицировали при использовании детергента CHAPS, наши результаты не выявили статистических отличий в количестве идентификаций при использовании различных детергентов. Тем не менее, исходя из удобства работы мы приняли решение провести выделение иммунопептидома опухолей аденокарциномы яичника с использованием детергента NP-40. 

В нашем исследовании было идентифицировано 5 пептидов, происходящих от белков из семейства CTA, в иммунопептидомах аденокарциномы яичника (Таблица 3). Согласно данным Human Protein Atlas, два из этих пяти CTA-белков экспрессируются в яичниках. Таким образом, в качестве потенциальных опухолевых антигенов при аденокарциноме яичника можно рассматривать только пептиды, соответствующие продуктам генов DPPA2, CCDC62 и SPAG17. При этом in silico анализ не предсказал ни для одного из них аффинности к исследуемым аллелям HLA I. Исходя из этого, идентифицированные нами пептиды не являются распространенными мишенями для иммунотерапии. Важно отметить, что из-за отсутствия данных по генотипированию HLA I у пациентов анализ проводили только для частых аллелей. Это могло привести к недооценке аффинности, если настоящие аллели пациентов не оказались в числе протестированных, что подчеркивает важность HLA-типирования для исследований в контексте персонализированной иммунотерапии. 

Помимо CTA, существуют и другие источники иммуногенных пептидов [33]. Кроме того, появляются данные о возможности индуцирования таких пептидов путем воздействия на клеточные процессы. Например, клеточный стресс, индуцированный радио- и химиотерапией, вызывает значительную перестройку процессов сплайсинга [34–36]. Это открывает возможности для поиска более универсальных опухоль-ассоциированных антигенов, таких как неоантигены, образующиеся из опухоль-специфических сплайс-вариантов [37]. Такие стресс-индуцированные лиганды HLA I, предсказанные как результат повреждений ДНК посредством рентгеновского облучения, были идентифицированы в иммунопептидоме опухолевых клеточных линий после обработки доксорубицином [38]. Таким образом, анализ иммунопептидома злокачественных опухолей после химиотерапии может помочь в поиске более универсальных опухоль-специфичных неоантигенов по сравнению с опухолями до лечения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный сравнительный анализ детергентов для лизиса клеток подтвердил, что каждый из них способствует выделению уникального набора пептидов, что имеет ключевое значение для полной характеризации иммунопептидома. Окончательный выбор детергента остается за исследователем, при этом глубина анализа может быть увеличена за счет использования нескольких различных детергентов, однако это сопряжено с ростом стоимости и трудоемкости, что противоречит современной тенденции к оптимизации этих параметров.

В качестве дальнейшего исследования обнаруженных нами пептидов мы планируем провести количественную оценку представленности этих пептидов методами таргетной протеомики, а также исследование их иммуногенности in vitro и in vivo. Кроме того, для характеризации иммунопептидома аденокарциномы яичника требуется увеличение выборки пациентов. При этом исследование следует проводить как до, так и после химиотерапии. Анализ опухолей после лечения может выявить уникальные терапевтические мишени, что в перспективе позволит повысить эффективность иммунотерапии за счет ее комбинации с химиотерапией.

×

References

  1. Gupta KK, Gupta VK, Naumann RW. Ovarian cancer: screening and future directions. Int J Gynecol Cancer 2019;29:195–200. https://doi.org/10.1136/ijgc-2018-000016.
  2. Sjoquist KM, Lord SJ, Friedlander ML, John Simes R, Marschner IC, Lee CK. Progression-free survival as a surrogate endpoint for overall survival in modern ovarian cancer trials: a meta-analysis. Ther Adv Med Oncol 2018;10:1758835918788500. https://doi.org/10.1177/1758835918788500.
  3. Lu Y, Wang A, Shi P, Zhang H, Li Z. Quantum chemical study on the antioxidation mechanism of piceatannol and isorhapontigenin toward hydroxyl and hydroperoxyl radicals. PLoS One 2015;10:e0133259. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0133259.
  4. Caruso G, Weroha SJ, Cliby W. Ovarian cancer: A review: A review. JAMA 2025;334:1278–91. https://doi.org/10.1001/jama.2025.9495.
  5. Wick W, Dietrich P-Y, Kuttruff S, Hilf N, Frenzel K, Admon A, van der Burg SH, von Deimling A, Gouttefangeas C, Kroep JR, Martinez-Ricarte F, Okada H, Ottensmeier CHH, Ponsati B, Poulsen HS, Stevanovic S, Tabatabai G, Rammensee H-G, Sahin U, Singh H, GAPVAC Consortium. GAPVAC-101: First-in-human trial of a highly personalized peptide vaccination approach for patients with newly diagnosed glioblastoma. J Clin Oncol 2018;36:2000–2000. https://doi.org/10.1200/jco.2018.36.15_suppl.2000.
  6. Kandalaft LE, Powell DJ Jr, Singh N, Coukos G. Immunotherapy for ovarian cancer: what’s next? J Clin Oncol 2011;29:925–33. https://doi.org/10.1200/JCO.2009.27.2369.
  7. Raja R, Mangalaparthi KK, Madugundu AK, Jessen E, Pathangey L, Magtibay P, Butler K, Christie E, Pandey A, Curtis M. Immunogenic cryptic peptides dominate the antigenic landscape of ovarian cancer. Sci Adv 2025;11:eads7405. https://doi.org/10.1126/sciadv.ads7405.
  8. Chiaro J, Peltonen K, Õunap K, Bailey A, Feola S, Wojciechowski S, Es-Haghi M, Azkargorta M, Elortza F, Russo S, Sallinen H, Anttila M, Gurvich O, Cerullo V, Kekarainen T. Proteogenomic approach to immunopeptidomics of ovarian tumors identifies shared peptide vaccine candidates. NPJ Vaccines 2025;10:195. https://doi.org/10.1038/s41541-025-01234-6.
  9. Schuster H, Peper JK, Bösmüller H-C, Röhle K, Backert L, Bilich T, Ney B, Löffler MW, Kowalewski DJ, Trautwein N, Rabsteyn A, Engler T, Braun S, Haen SP, Walz JS, Schmid-Horch B, Brucker SY, Wallwiener D, Kohlbacher O, Fend F, Rammensee H-G, Stevanović S, Staebler A, Wagner P. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proc Natl Acad Sci U S A 2017;114:E9942–51. https://doi.org/10.1073/pnas.1707658114.
  10. Purcell AW, Ramarathinam SH, Ternette N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nat Protoc 2019;14:1687–707. https://doi.org/10.1038/s41596-019-0133-y.
  11. Sirois I, Isabelle M, Duquette JD, Saab F, Caron E. Immunopeptidomics: Isolation of mouse and human MHC class I- and II-associated peptides for mass spectrometry analysis. J Vis Exp 2021. https://doi.org/10.3791/63052-v.
  12. Chong C, Marino F, Pak H, Racle J, Daniel RT, Müller M, Gfeller D, Coukos G, Bassani-Sternberg M. High-throughput and sensitive immunopeptidomics platform reveals profound interferonγ-mediated remodeling of the human leukocyte antigen (HLA) ligandome. Mol Cell Proteomics 2018;17:533–48. https://doi.org/10.1074/mcp.TIR117.000383.
  13. Reynisson B, Alvarez B, Paul S, Peters B, Nielsen M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Res 2020;48:W449–54. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa379.
  14. Kuznetsov A, Voronina A, Govorun V, Arapidi G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules 2020;25:5409. https://doi.org/10.3390/molecules25225409.
  15. Vizcaíno JA, Kubiniok P, Kovalchik KA, Ma Q, Duquette JD, Mongrain I, Deutsch EW, Peters B, Sette A, Sirois I, Caron E. The Human Immunopeptidome Project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Mol Cell Proteomics 2020;19:31–49. https://doi.org/10.1074/mcp.R119.001743.
  16. Nicastri A, Liao H, Muller J, Purcell AW, Ternette N. The choice of HLA-associated peptide enrichment and purification strategy affects peptide yields and creates a bias in detected sequence repertoire. Proteomics 2020;20:e1900401. https://doi.org/10.1002/pmic.201900401.
  17. Klein E, Ben-Bassat H, Neumann H, Ralph P, Zeuthen J, Polliack A, Vánky F. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer 1976;18:421–31. https://doi.org/10.1002/ijc.2910180405.
  18. Arshad S, Cameron B, Joglekar AV. Immunopeptidomics for autoimmunity: unlocking the chamber of immune secrets. NPJ Syst Biol Appl 2025;11:10. https://doi.org/10.1038/s41540-024-00482-x.
  19. Willems P, Thery F, Van Moortel L, De Meyer M, Staes A, Gul A, Kovalchuke L, Declercq A, Devreese R, Bouwmeester R, Gabriels R, Martens L, Impens F. Maximizing immunopeptidomics-based bacterial Epitope discovery by multiple search engines and rescoring. J Proteome Res 2025;24:2141–51. https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.4c00864.
  20. Leddy OK, White FM, Bryson BD. Leveraging immunopeptidomics to study and combat infectious disease. mSystems 2021;6:e0031021. https://doi.org/10.1128/mSystems.00310-21.
  21. Tretter C, de Andrade Krätzig N, Pecoraro M, Lange S, Seifert P, von Frankenberg C, Untch J, Zuleger G, Wilhelm M, Zolg DP, Dreyer FS, Bräunlein E, Engleitner T, Uhrig S, Boxberg M, Steiger K, Slotta-Huspenina J, Ochsenreither S, von Bubnoff N, Bauer S, Boerries M, Jost PJ, Schenck K, Dresing I, Bassermann F, Friess H, Reim D, Grützmann K, Pfütze K, Klink B, Schröck E, Haller B, Kuster B, Mann M, Weichert W, Fröhling S, Rad R, Hiltensperger M, Krackhardt AM. Proteogenomic analysis reveals RNA as a source for tumor-agnostic neoantigen identification. Nat Commun 2023;14:4632. https://doi.org/10.1038/s41467-023-39570-7.
  22. Cai Y, Gong M, Zeng M, Leng F, Lv D, Guo J, Wang H, Li Y, Lin Q, Jing J, Zhang Y, Xu J, Li Y. Immunopeptidomics-guided discovery and characterization of neoantigens for personalized cancer immunotherapy. Sci Adv 2025;11:eadv6445. https://doi.org/10.1126/sciadv.adv6445.
  23. Gurung HR, Heidersbach AJ, Darwish M, Chan PPF, Li J, Beresini M, Zill OA, Wallace A, Tong A-J, Hascall D, Torres E, Chang A, Lou K ’hei-Wai', Abdolazimi Y, Hammer C, Xavier-Magalhães A, Marcu A, Vaidya S, Le DD, Akhmetzyanova I, Oh SA, Moore AJ, Uche UN, Laur MB, Notturno RJ, Ebert PJR, Blanchette C, Haley B, Rose CM. Systematic discovery of neoepitope-HLA pairs for neoantigens shared among patients and tumor types. Nat Biotechnol 2024;42:1107–17. https://doi.org/10.1038/s41587-023-01945-y.
  24. Spizzo G, Fong D, Wurm M, Ensinger C, Obrist P, Hofer C, Mazzoleni G, Gastl G, Went P. EpCAM expression in primary tumour tissues and metastases: an immunohistochemical analysis. J Clin Pathol 2011;64:415–20. https://doi.org/10.1136/jcp.2011.090274.
  25. Charkhchi P, Cybulski C, Gronwald J, Wong FO, Narod SA, Akbari MR. CA125 and ovarian cancer: A comprehensive review. Cancers (Basel) 2020;12:3730. https://doi.org/10.3390/cancers12123730.
  26. Bassani-Sternberg M, Bräunlein E, Klar R, Engleitner T, Sinitcyn P, Audehm S, Straub M, Weber J, Slotta-Huspenina J, Specht K, Martignoni ME, Werner A, Hein R, H Busch D, Peschel C, Rad R, Cox J, Mann M, Krackhardt AM. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nat Commun 2016;7:13404. https://doi.org/10.1038/ncomms13404.
  27. Shraibman B, Barnea E, Kadosh DM, Haimovich Y, Slobodin G, Rosner I, López-Larrea C, Hilf N, Kuttruff S, Song C, Britten C, Castle J, Kreiter S, Frenzel K, Tatagiba M, Tabatabai G, Dietrich P-Y, Dutoit V, Wick W, Platten M, Winkler F, von Deimling A, Kroep J, Sahuquillo J, Martinez-Ricarte F, Rodon J, Lassen U, Ottensmeier C, van der Burg SH, Thor Straten P, Poulsen HS, Ponsati B, Okada H, Rammensee H-G, Sahin U, Singh H, Admon A. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Mol Cell Proteomics 2019;18:1255–68. https://doi.org/10.1074/mcp.RA119.001524.
  28. Whitehurst AW. Cause and consequence of cancer/testis antigen activation in cancer. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2014;54:251–72. https://doi.org/10.1146/annurev-pharmtox-011112-140326.
  29. Gomez-Zepeda D, Arnold-Schild D, Beyrle J, Declercq A, Gabriels R, Kumm E, Preikschat A, Łącki MK, Hirschler A, Rijal JB, Carapito C, Martens L, Distler U, Schild H, Tenzer S. Thunder-DDA-PASEF enables high-coverage immunopeptidomics and is boosted by MS2Rescore with MS2PIP timsTOF fragmentation prediction model. Nat Commun 2024;15:2288. https://doi.org/10.1038/s41467-024-46380-y.
  30. Beyrle J, Distler U, Gomez-Zepeda D, Tenzer S. MAETi: Mild acid elution in a tip enables immunopeptidome profiling from 25,000 cells. Immunology 2024.
  31. Ternette N, Block PD, Sánchez-Bernabéu Á, Borthwick N, Pappalardo E, Abdul-Jawad S, Ondondo B, Charles PD, Dorrell L, Kessler BM, Hanke T. Early kinetics of the HLA class I-associated peptidome of MVA.HIVconsv-infected cells. J Virol 2015;89:5760–71. https://doi.org/10.1128/JVI.03627-14.
  32. Jurtz V, Paul S, Andreatta M, Marcatili P, Peters B, Nielsen M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. J Immunol 2017;199:3360–8. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1700893.
  33. Capietto A-H, Hoshyar R, Delamarre L. Sources of cancer neoantigens beyond single-nucleotide variants. Int J Mol Sci 2022;23:10131. https://doi.org/10.3390/ijms231710131.
  34. Darrigrand R, Pierson A, Rouillon M, Renko D, Boulpicante M, Bouyssié D, Mouton-Barbosa E, Marcoux J, Garcia C, Ghosh M, Alami M, Apcher S. Isoginkgetin derivative IP2 enhances the adaptive immune response against tumor antigens. Commun Biol 2021;4:269. https://doi.org/10.1038/s42003-021-01801-2.
  35. Anufrieva KS, Shender VО, Arapidi GP, Pavlyukov MS, Shakhparonov MI, Shnaider PV, Butenko IO, Lagarkova MA, Govorun VM. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Med 2018;10:49. https://doi.org/10.1186/s13073-018-0557-y.
  36. Melacarne A, Ferrari V, Tiraboschi L, Mishto M, Liepe J, Aralla M, Marconato L, Lizier M, Pozzi C, Zeira O, Penna G, Rescigno M. Identification of a class of non-conventional ER-stress-response-derived immunogenic peptides. Cell Reports 2021;36:109312. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109312.
  37. Kwok DW, Stevers NO, Etxeberria I, Nejo T, Colton Cove M, Chen LH, Jung J, Okada K, Lakshmanachetty S, Gallus M, Barpanda A, Hong C, Chan GKL, Liu J, Wu SH, Ramos E, Yamamichi A, Watchmaker PB, Ogino H, Saijo A, Du A, Grishanina NR, Woo J, Diaz A, Hervey-Jumper SL, Chang SM, Phillips JJ, Wiita AP, Klebanoff CA, Costello JF, Okada H. Tumour-wide RNA splicing aberrations generate actionable public neoantigens. Nature 2025;639:463–73. https://doi.org/10.1038/s41586-024-08552-0.
  38. Uchihara Y, Permata TBM, Sato H, Kawabata-Iwakawa R, Katada S, Gu W, Kakoti S, Yamauchi M, Kato R, Gondhowiardjo S, Hosen N, Yasuhara T, Shibata A. DNA damage promotes HLA class I presentation by stimulating a pioneer round of translation-associated antigen production. Mol Cell 2022;82:2557–70.e7. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.04.030.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) Eco-Vector

License URL: https://eco-vector.com/for_authors.php#07
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: