Raptor-Mediated Regulation of Replicative Aging of Human Skin Fibroblasts

Full Text

Введение

Во время развития и старения человека клеточный метаболизм требует разного количества ресурсов: факторов роста, питательных веществ, энергии и макромолекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты, липиды и углеводы.

В регуляции клеточного гомеостаза и в контроле репликативной способности клеток в антенатальный и постнатальный периоды онтогенеза задействован сигнальный путь mTOR [1, 2]. Изменение клеточного метаболизма, связанное с возрастом [3, 9] или различными заболеваниями, такими как рак, сахарный диабет 2 типа и дегенеративные неврологические расстройства [1, 5], в том числе опосредовано mTOR-сигнализацией.

mTOR (от англ. «mammalian target of rapamycin») представляет собой атипичную серин/треониновую (S/T) протеинкиназу массой 289 кДа, принадлежащую к семейству фосфоинозитид-3-киназ-родственных киназ (PI3–K), и присутствует у всех эукариот [1].

mTOR взаимодействует с несколькими белками, образуя два различных комплекса  – mTORC1 и mTORC2 [3]. mTORC1 состоит из трех компонентов: mTOR, белка SEC138 (mLST8) и регуляторно-ассоциированного белка Raptor (от англ. Regulatory-associated protein of mTOR), который необходим для распознавания специфических субстратов [4]. Комплекс белков mTORC1 определяет восприимчивость к питательным веществам, таким как аминокислоты и глюкоза, контролируя рост клетки путем активации анаболических процессов. Для активации mTORC1 требуются цитоплазматические ГТФазы, такие как Rag ГТФаза (англ. recombination activation genes) и Rheb ГТФаза (от англ. Ras homolog enriched in brain). При этом Rag ГТФаза взаимодействует с Raptor при наличии питательных веществ в цитоплазме клетки и перемещает mTORC1 на поверхность лизосом, где последняя активируется Rheb ГТФазой [4].

Сигнальный путь mTOR участвует в морфогенезе кожи, регулируя дифференцировку кератиноцитов, включая эпидермальную стратификацию и образование волосяных фолликулов [5, 6]. Мультипротеиновые комплексы mTOR (mTORC1 и mTORC2) регулируют процессы формирования защитного эпидермального барьера, обуславливая ранние и конечные стадии эпидермальной дифференцировки [6]. mTOR регулирует содержание нуклеотидов в процессе роста клеток кожи, а mTORC1 контролирует биосинтез пуринов и пиримидина [7]. mTORC1 является основным регулятором аутофагии. Он способствует подавлению аутофагии с целью снижения катаболизма вновь синтезированных клеточных компонентов и биосинтеза лизосом. Активация аутофагии происходит при участии серин/треониновой киназы ULK1, которая активируется при стрессовых или дефицитных условиях [8].

Следует отметить, что к настоящему времени данные по локализации и содержанию субъединицы Raptor мультипротеинового комплекса mTORC1 в коже человека в возрастном ракурсе отсутствуют. Между тем, известно, что снижение уровня Raptor коррелирует с нарушением функциональной активности mTORC1 и может быть связано с процессами клеточной сенесценции, включая репликативное старение [9, 10].

Таким образом, старение кожи связано с сигнальным путем mTOR, ингибирование mTOR может оказывать противовозрастное действие. Однако данные о представленности Raptor, одного из важнейших маркеров и потенциальных мишеней для модуляции репликативного старения дермальных фибробластов отсутствуют.

Цель

Изучение динамических изменений экспрессии Raptor в фибробластах дермы в процессе развития и старения кожи человека.

Материалы и Методы

В качестве материала исследования использовали микропрепараты кожи человека, полученные при аутопсии в возрастном диапазоне от 20 недель внутриутробного развития до 85 лет. Всего исследовано 134 фрагмента кожи плодов, мужчин и женщин.

Для верификации структур кожи человека (плода) проведено традиционное окрашивание срезов гематоксилином и эозином.

Для оценки экспрессии Raptor в фибробластах применён иммуногистохимический (ИГХ) метод и использованы первичные поликлональные кроличьи антитела к Raptor (GTX132303, GeneTex, США, разведение 1:50). Для определения общей численности фибробластов в дерме применяли виментин (GTX100619, GeneTex, США, разведение 1:50) - маркер промежуточных филаментов. Активность пролиферации фибробластов в разные возрастные периоды была оценена с помощью ИГХ-реакции к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) (AHP1419, AbD Serotec, Великобритания, 1:100). Для визуализации антигена применяли кроличью полимерную систему, конъюгированную с пероксидазой (GTX83399, GeneTex, США). Определение активности пероксидазы проводили с использованием перекиси водорода и диаминобензидина (Sigma Chemical Co., США). Структуры, экспрессирующие Raptor, виментин и PCNA имели коричневый цвет, ядра клеток докрашивали гематоксилином. При использовании 1% кроличьей сыворотки с целью контроля специфичности ИГХ-окрашивания положительной реакции не выявлено.

Морфологическое исследование окрашенных препаратов, в том числе количественный и качественный анализы, проводили с помощью микроскопа Nikon Eclipse 200 и камеры DS-Ri2 (Япония). Фотографирование микропрепаратов кожи человека (плода) осуществляли при увеличении х400 в трех-пяти случайно выбранных полях зрения. В полученных микрофотографиях предварительно вычисляли площадь исследуемых участков срезов кожи с помощью программы NIS-Elements Br («Nikon», Япония), далее подсчитывали численность фибробластов дермы положительно окрашенных на Raptor и PCNA, а также их общую численность при окрашивании на виментин на 1 мм² дермы. В результате мы оценивали процентное содержание позитивных фибробластов к общему числу фибробластов на 1 мм² дермы в случае каждого маркера. Весь массив полученных данных был дешифрован и разделен на 5 групп по возрастному признаку. По каждой группе были рассчитаны средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (m).

В качестве статистической обработки материала использовали t-критерий Стьюдента, непараметрический корреляционный метод Спирмена, однофакторный дисперсионный анализ (фактор - возраст). В работе не учитывали гендерную принадлежность изучаемых срезов кожи человека (плода) ввиду того, что однофакторный дисперсионный анализ не выявил достоверного (p<0,05) влияния данного фактора на изменение количества Raptor+, виментин+, PCNA+ фибробластов в дерме кожи человека

Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова» (Протокол № 04 от 15.11.2021).

Результаты

По результатам проведенного исследования Raptor+ фибробласты были выявлены во всех образцах кожи плодов, мужчин и женщин, начиная от 20 недель внутриутробного развития вплоть до 85 летнего возраста. Однако доля Raptor+ фибробластов имела возрастные особенности.

На этапе антенатального развития (20–40 недель внутриутробного возраста) доля Raptor+ фибробластов составила 92,8±0,9% (M±m) (рис. 1 a, рис. 2а). Общее число фибробластов в коже плодов достигало 4893,2±387,7 клеток на 1 мм² дермы (рис. 1 b), при этом 46% из них имели положительную реакцию к PCNA (рис. 1 c).

Рисунок 1. Результаты иммуногистохимического окрашивания в возрастной динамике. a- доля raptor+ фибробластов, b – доля PCNA+ фибробластов, c – доля виментин+ фибробластов по отношению к общему числу фибробластов в дерме человека (M±m) (p<0,05). По оси абсцисс – возрастные группы, по оси ординат – рисунок a, c – доля фибробластов имеющих положительное окрашивание по отношению к общему числу фибробластов на 1 мм², b – общее число фибробластов на 1 мм²

Figure 1. Results of immunohistochemical staining across age-related dynamics. (a) Proportion of Raptor+ fibroblasts, (b) proportion of PCNA+ fibroblasts, (c) proportion of vimentin+ fibroblasts relative to the total fibroblast population in human dermis (M ± SEM) (p < 0.05).On the x-axis – age groups; on the y-axis – for (a) and (c): percentage of fibroblasts showing positive staining relative to the total number of fibroblasts; for (b): fibroblast count per 1 mm².

Рисунок 2. Raptor+ фибробласты в коже плода мужского пола 22 недель внутриутробного развития (a) и мужчины в возрасте 75 лет (b).

Figure 2. Raptor+ fibroblasts in the skin of a male fetus at 22 weeks of gestation (a) and a 75-year-old male (b).

Во второй возрастной группе (от рождения до 20 лет) доля Raptor+ фибробластов достоверно не изменилась по сравнению с плодами (рис. 1 a). Однако, общее содержание виментин+ фибробластов достоверно снизилось в 2,4 раза (p<0,001, t-тест Стьюдента), а PCNA+ фибробластов в 1,4 раза (p<0,001, t-тест Стьюдента) по сравнению с группой 1.

В возрастной период от 21 года до 40 лет было выявлено 89,1±1,4% фибробластов с экспрессией Raptor (рис. 1 a). Виментин+ фибробласты в данной группе составляли 1454,1±97,2 клеток на 1 мм² дермы (рис. 1 b), что в 1,4 раза ниже по сравнению с группой 2. Доля PCNA+ фибробластов была достоверно ниже по отношению к предыдущему возрасту и составила 23,8±3,4% (p<0,01, t-тест Стьюдента) (рис. 1 c).

Доля Raptor+ фибробластов в возрастной группе от 41 года до 60 лет составила 88, 8±0,9% (рис. 1 a), что статистически достоверно отличается от значений группы 3 (p<0,001, t-тест Стьюдента). Общее содержание виментин+ фибробластов снизилось на уровне тенденции до 1406,2±51,9 клеток на 1 мм² дермы (рис. 1 b) в сравнении с 3-й группой (p<0,01). Доля PCNA+ фибробластов в этот возрастной период составляла 21,5±3,4% (рис. 1 c), статистическая значимость по сравнению с предыдущей группой не установлена (p>0,05).

В пожилом возрасте (от 61 до 85 лет) доля Raptor+ фибробластов уменьшилась до 87,2±1,3% (рис. 1 a), что статистически достоверно ниже показателя группы 4 (p<0,01, t-тест Стьюдента). Общее число виментин+ фибробластов снизилось до 1349,4±42,4 клеток на 1 мм² дермы (рис. 1 b, рис 2b) (p<0,01). Доля PCNA+ фибробластов в этой группе составила 21,7±2,1% (рис. 1 c), что не отличается от показателей группы 4 (p>0,05).

Результаты однофакторного дисперсионного анализа (фактор – возраст) подтвердили наличие статистически значимых динамических изменений экспрессии Raptor (p<0,05), а также. достоверно значимое влияние возраста на содержание виментин+ (p < 0,001) и PCNA+ (p < 0,001) фибробластов в дерме в процессе развития и старения кожи человека.

Методом непараметрической корреляции Спирмена установлена положительная корреляция между долей Raptor+ фибробластов и общей численностью фибробластов в дерме (r=0,27, p<0,05), между долей Raptor+ фибробластов и долей пролиферирующих фибробластов (r=0,21, p<0,05).

Обсуждение

В результате проделанного исследования, установлено, что Raptor+ фибробласты выявляются в коже человека от 20 недель внутриутробного развития до 85-летнего возраста. Доля фибробластов экспрессирующих специфичный для mTORC1 белок Raptor во временном аспекте статистически значимо снижается, однако во все возрастные периоды доля таких клеток значительно превалирует по сравнению с Raptor-негативными фибробластами. Согласно литературным данным комплекс mTORC1 усиливает анаболические пути для производства различных биомолекул, таких как белки, липиды, нуклеотиды, и подавляет катаболические пути, ведущие к аутофагии [9–12]. Эти процессы важны для роста и деления клеток, которые реализуются в антенатальный период по всей видимости с участием Raptor [3].

В коже человека после рождения наблюдается экспоненциальное снижение численности фибробластов [12, 13]. В этот же возрастной период происходит уменьшение доли пролиферирующих фибробластов, что частично объясняет возрастную отрицательную динамику изменения общего числа фибробластов в дерме. Однако доля Raptor+ фибробластов после рождения сохраняется на уровне более 90%. Можно предположить, что Raptor-опосредованные механизмы стимулирующие пролиферацию в постнатальный период сдерживаются негативными регуляторами. В их числе аминокислотный дефицит (например, лейцина) ингибирует гетеродимеры Rag (англ. recombination activation genes), которые могут связываться с Raptor, что приводит к привлечению mTORC1 на лизосомальную поверхность, где расположен комплекс RHEB-ГТФ (ГТФ-связывающий гомолог Ras, обогащенный мозговым белком). Активация mTORC1 может произойти только в случае единомоментной активации Rag и RHEB [3]. В то же время RHEB может подавляться TNF-зависимым механизмом через ингибитор субъединицы бета киназы ядерного фактора каппа-B (IKKβ). В наших предыдущих исследованиях было продемонстрировано увеличение доли TNF+ фибробластов в дерме от рождения до 20 лет в 3,3 раза [14], ингибирование RHEB в свою очередь будет активировать комплекс mTORC1 и стимулировать процессы пролиферации, подавляя аутофагию [3]. Согласно данным литературы процессы аутофагии в фибробластах дермы носят протективный характер, например, при воздействии УФ-излучения, путём удаления повреждённых органелл и белковых агрегатов [11, 12], что необходимо для структурного обеспечения репликативных процессов. Все функциональные механизмы требуют достаточного уровня глюкозы и АТФ в клетке, поэтому могут создаться условия активации 5'-аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (AMPK) – стресс-чувствительного метаболического регулятора. Активированная AMPK может ингибировать mTORC1 двумя различными способами: путем фосфорилирования Raptor происходит прямое ингибирование mTORC1, а фосфорилирование и последующая активация комплекса туберозного склероза 2 (TSC2) приводят к косвенному ингибированию mTORC1 [3]. Через нижестоящие эффекторы mTORC1 – рибосомальную протеинкиназу S6 бета-1 (S6K1) и 4EBP1 (от англ. eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1) – контролируется синтеза белка, а ингибирование аутофагии происходит посредством ингибирования эффектора ULK1 (от англ. unc-51 like autophagy activating kinase 1) [7, 8]. Наблюдаемое в исследовании возрастное снижение активности mTORC1 через уменьшение экспрессии Raptor в фибробластах вероятностно может обуславливать адаптивный сдвиг в сторону усиления аутофагии в коже. В этом контексте снижение Raptor может быть частью компенсаторного механизма, направленного на минимизацию накопления клеточного повреждения и сохранение жизнеспособности оставшихся фибробластов.

Выявленная положительная корреляция между долей Raptor+ фибробластов и их пролиферативной активностью подтверждает участие Raptor в процессах репликативного старения фибробластов дермы, сопровождающееся снижением пролиферативного потенциала и изменением секреторного профиля [10]. Таким образом, Raptor может выступать как интегральный регулятор репликативного статуса стромальных клеток кожи.

Корреляция между возрастом, PCNA и виментин подтверждает, что снижение Raptor+ фибробластов вероятностно связано с потерей регенеративного потенциала фибробластов кожи человека [7, 15].     

Учитывая, что mTOR как точка воздействия при антивозрастной терапии подтверждается современными исследованиями, демонстрирующими, что модуляция участников сигнального пути mTOR способна замедлять процессы старения [9, 10], следует предполагать, что ингибирование mTOR сигнального пути, через субъединицу Raptor, может улучшать метаболические функции дермальных фибробластов, что будет поддерживать их регенеративный потенциал и, возможно, открывает путь для клинического применения mTOR-ингибиторов в геронтологии. Полученные нами данные расширяют эти представления, указывая на Raptor как на потенциальный маркер и мишень для терапевтического вмешательства в процессы старения дермы.

Заключение

Доля Raptor+ фибробластов в дерме человека достоверно снижается с 92,8% на этапе эмбрионального развития (20 недель гестации) до 87,2% к 85 годам (p<0,05), что подтверждает возрастную специфику регуляции сигнального пути mTORC1 и значимость Raptor как маркера функциональной активности фибробластов кожи.

В постнатальном онтогенезе наблюдается постепенное снижение экспрессии Raptor, отражающее перестройку пролиферативного и метаболического статуса фибробластов. Выявленная однонаправленная динамика изменения доли Raptor+, PCNA+ и виментин+ фибробластов указывает на тесную функциональную связь между экспрессией Raptor и пролиферативным потенциалом клеток, что позволяет рассматривать его как потенциальный молекулярный регулятор репликативного старения фибробластов дермы.

Снижение экспрессии Raptor в постнатальный период может быть связано с переходом от анаболического метаболизма к катаболическим процессам, включая активацию аутофагии, и служить адаптационным механизмом, направленным на сохранение тканевого гомеостаза при возрастных и стрессовых воздействиях.

Установленная корреляция между экспрессией Raptor и пролиферативной активностью фибробластов открывает перспективы для дальнейших исследований роли mTORC1 в контексте репликативного старения фибробластов кожи.

Дополнительная информация

Вклад авторов / Author contributions

Концепция и дизайн исследования – Н.Н. Голубцова, А.Г. Гунин. Сбор и обработка материала – Т.Н. Прокопьева, Н.Н. Голубцова. Анализ данных – Т.Н. Прокопьева, Н.Н. Голубцова, А.Г. Гунин. Написание текста и оформление статьи – Т.Н. Прокопьева, Н.Н. Голубцова. Редактирование – Н.Н. Голубцова. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Author contributions.

Conceptualization, design of research – N.N.  Golubtsova, A.G. Gunin. Conducting a research process, data collection – N.N.  Golubtsova, T.N. Prokopeva. Analysis of research data – T.N. Prokopeva, N.N. Golubtsova, T.N. A.G. Gunin. Сreation of the published work, specifically writing the initial draft – T.N. Prokopeva, N.N. Golubtsova. Сritical review, revision – N.N.  Golubtsova. All authors approved the manuscript (version for publication) and agreed to take responsibility for all aspects of the work, ensuring the proper consideration and resolution of any issues related to the accuracy and integrity of any part of the study.

 Благодарности / Acknowledgments

Благодарности. Авторы выражают признательность БУ "Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы" Минздрава Чувашии за предоставление аутопсийного материала.

Acknowledgments. The authors are grateful to the Republican Bureau of Forensic Medical Examination, Ministry of Health of the Chuvash Republic, for providing autopsy materials.

Этическая экспертиза / Ethics approval

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова (протокол № 04 от 15.11.2021).

Ethics approval. The study was approved by the local ethics committee of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education “Chuvash State University named after I.N. Ulyanov” (on the record No. 04 dated 11/15/2021).

Согласие на публикацию / Consent for publication

Согласие на публикацию. Неприменимо.

Consent for publication. Not applicable.

Источники финансирования / Funding sources

Источники финансирования. Исследование проведено с использованием денежных средств гранта научных школ ЧГУ (№ 23-21).

Funding sources. The study was conducted using funds from the grant of the scientific school of ChSU, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education “Chuvash State University named after I.N. Ulyanov” (No. 23-21).

Раскрытие интересов / Disclosure of interest

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Disclosure of interests. The authors have no relationships, activities or interests for the last three years related with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Оригинальность / Statement of originality

Оригинальность. При создании настоящей работы были использованы фрагменты собственного текста: графики, опубликованные ранее (DOI 10.34922/AE.2023.36.4.017).

Statement of originality. This work contains some parts of author's work published prior (charts from DOI 10.34922/AE.2023.36.4.017).

Доступ к данным / Data availability statement

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье и в приложении к ней.

Data availability statement. All data obtained in this study are available in the article and the supplement.

Генеративный искусственный интеллект / Generative AI

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Generative AI. Generative AI technologies were not used for this article creation.

Дисклеймер

Дисклеймер. Неприменимо.

Consent for publication. Not applicable.

About the authors

Natalya Golubtsova

Author for correspondence.
Email: golubnata@list.ru

Tatiana N. Prokopeva

Email: doctor.geriayr@gmail.com

Andrei Germanovich Gunin

Email: drgunin@mail.ru

References

Supplementary files