Epidermal growth factor receptor as a target of antitumor activity of binase mutants

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Известно, что ферменты, участвующие в метаболизме РНК, способны индуцировать гибель опухолевых клеток. Противоопухолевые свойства обнаружены у рибонуклеаз (РНКаз) различного происхождения, включая РНКазы млекопитающих (BS-РНКаза, РНКаза А) [1, 2], амфибий (онконаза) [3], грибов (альфа-сарцин) [4] и бактерий (биназа, барназа и др.) [5, 6]. Молекулярные механизмы онколитического действия РНКаз сильно разнятся, однако первостепенная роль в проявлении их цитотоксичности обусловлена способностью ферментов гидролизовать внутриклеточную РНК. Для инициации апоптоза в опухолевых клетках достаточно наличия минимального уровня каталитической активности. Так, РНКаза Rana pipiens (онконаза) теряла цитотоксический эффект при остаточной активности 2%, а катионные мутанты РНКазы А и РНКазы 1 человека — при 0,01% [7, 8]. Для РНКазы Bacillus pumilus (биназы) цитотоксичность остаётся неизменной при остаточной активности 11,0%, полученной при точечной замене K26A, и пропадает при активности 0,02% в случае мутантной формы H101E [9]. Снижение РНКазной активности ослабляет генотоксические [10] и нефротоксические [11] эффекты нативного фермента, что является несомненным преимуществом для разработки потенциальных противоопухолевых препаратов на основе мутантов биназы.

Помимо каталитической активности вклад в антипролиферативные свойства биназы вносят заряд молекулы, способность к белок-белковому взаимодействию с клеточными компонентами, отсутствие чувствительности к ингибитору РНКаз млекопитающих RI, а также олигомерная структура белков [12–15]. Показано, что значимую роль в апоптоз-индуцирующем действии биназы играет её способность модулировать активность сигнального пути митоген-активируемых протеинкиназ (mitogen-activated protein kinase, МАРК) посредством взаимодействия с рецептором эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) и онкогеном RAS [15, 16].

Сигнальный каскад МАРК, регулируемый EGFR, включает три основных сигнальных пути RAS/RAF/MAPK, PI3K/Akt/mTOR, JAK/STAT и контролирует жизненно-важные процессы в клетке, такие как пролиферация, дифференцировка, выживаемость и апоптоз [17]. Генетические нарушения в компонентах сигнальных путей приводят к злокачественной трансформации клеток. Поиск агентов, способных модулировать МАРК-каскад за счёт прямого взаимодействия с EGFR, — одно из многообещающих направлений в противоопухолевой терапии.

ЦЕЛЬ

Целью данной работы стала оценка вклада взаимодействия мутантных форм биназы с EGFR в их цитотоксический потенциал.

МЕТОДЫ

Условия культивирования опухолевых клеток

Культуру клеток эпидермоидной карциномы человека А431 (ATCC CRL 1555) растили на среде DMEM («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, пенициллина–стрептомицина и канамицина (по 100 ед./мл) при температуре 37 °С в атмосфере 5% СО₂.

Цитотоксические агенты

Клетки обрабатывали РНКазой B. pumilus — биназой (12,2 кДа, pI 9,5) — и её мутантными производными со сниженной каталитической активностью K26A и H101E, полученными ранее [9]. Ферменты использовали в диапазоне концентраций 10–300 мкг/мл. Моноклональное антитело к рецептору EGFR — цетуксимаб (Merck, Германия) — использовали в концентрации 100 мкг/мл.

Оценка пролиферативной способности клеток

Пролиферативную активность клеток оценивали в МТТ-тесте. Клетки засевали в 96-луночные плоскодонные планшеты в количестве 1,5 · 10⁴ на лунку и растили до образования 60% монослоя. Среду заменяли на свежую с добавлением РНКаз (10–300 мкг/мл) и/или цетуксимаба (100 мкг/мл), клетки инкубировали в течение 48 ч. Последовательную обработку клеток проводили, инкубируя их с цетуксимабом в течение 24 ч, затем среду заменяли на свежую с РНКазами и инкубировали еще 48 ч. Далее среду отбирали, добавляли 0,5 мг/мл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида (МТТ; «Диаэм», Россия) и инкубировали до образования кристаллов формазана, которые затем растворяли в диметилсульфоксиде («Татхимфармпрепараты», Россия). Оптическую плотность раствора измеряли по разности поглощения при длинах волн Δ(А570–А630) на спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США). Жизнеспособность необработанных клеток принимали за 100%. Долю жизнеспособных клеток рассчитывали по формуле: Доля жизнепособных клеток (%) = (OП обработанной группы − OП среды) / (OП контрольной группы − OП среды) × 100.

Оценка миграционной активности клеток

Миграционную активность клеток оценивали в стандартном тесте на зарастание царапины. Клетки засевали в 24-луночные плоскодонные планшеты по 3,5 · 10⁵ на лунку и растили до образования монослоя. По поверхности монослоя с помощью наконечника для автоматической пипетки (200 мкл) проводили прямые линии шириной ~ 1,2 мм. Далее клетки промывали фосфатно-солевым буфером (NaCl — 8,0 г/л; KCl — 0,2 г/л; Na₂HPO₄ — 1,44 г/л; KH₂PO₄ — 0,24 г/л; pH 7,4) для удаления открепившихся и инкубировали в бессывороточной среде с РНКазами в диапазоне концентраций 10–100 мкг/мл в течение 48 ч. Степень зарастания «царапины» оценивали в нулевой временнóй точке и после культивирования в течение 24 и 48 ч, изображения фиксировали с помощью микроскопа Axio Imager 2 (Carl Zeiss, Япония). Площадь царапины измеряли с использованием сервисной опции free hand selection программного пакета ImageJ [18]. Степень зарастания царапины (d) рассчитывали по формуле: d = (1 − S_t / S₀) × 100%, где S_t — площадь царапины через 24 и 48 ч после нанесения царапины; S₀ — площадь царапины в нулевой временнóй точке.

Иммунофлуоресцентный анализ

Клетки засевали в количестве 1,8 · 10⁴ на стерильные покровные стекла, помещённые в лунки 48-луночного плоскодонного планшета, и растили до достижения 80% монослоя. Затем клетки обрабатывали РНКазами (100 мкг/мл) в течение 1 мин, 5 мин, 15 мин, 1 ч и 6 ч или цетуксимабом (100 мкг/мл) в течение 24 ч. Для определения уровня фосфорилирования киназы ERK1/2 клетки последовательно обрабатывали цитотоксическими агентами, промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали с эпидермальным фактором роста (epidermal growth factor, EGF; Sigma-Aldrich, США) в концентрации 100 нг/мл в течение 30 мин. Подготовку клеток к иммуноокрашиванию проводили по методике, описанной ранее [14]. Клетки инкубировали с первичными кроличьими антителами к биназе (1:25, получены ранее [19]) и p-ERK1/2 (1:75; Abclonal, Китай), мышиными антителами к EGFR (1:50; Santa Cruz, США) при 4 °С в течение ночи. Затем клетки инкубировали со вторичными антимышиными антителами козы, конъюгированными с Alexa Fluor 555 (1:200; Abcam, США), и антикроличьими антителами козы, конъюгированными с Alexa Fluor 647 (0,1 мкг/10⁶ клеток; Abcam, США) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Для окраски клеточных ядер клетки инкубировали в течение 15 мин с 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (Servicebio, Китай) при 37 °С. Клетки консервировали в среде для фиксации биологического материала (Servicebio, Китай). Визуализацию белков проводили с помощью лазерного сканирующего микроскопа Olympus IX83 (Olympus, Япония), оснащённого модулем STEDYCON (Abberior Instruments, Германия) для конфокальной визуализации, при длине волны возбуждения лазера 405 нм для 4,6-диамидино-2-фенилиндола, 647 нм — для Alexa Fluor 647 и 488 нм — для Alexa Fluor 555.

Моделирование

Для моделирования использовали кристаллическую структуру биназы дикого типа из базы данных Protein Data Bank (1GOU). Трёхмерные структуры тирозинкиназного домена EGFR и мутантных форм биназы K26A и H101E моделировали с использованием алгоритма AlphaFold 3 [20]. Затем на веб-сервере ClusPro [21] предсказывали возможные конфигурации гетеродимеров тирозинкиназного домена EGFR и одной из форм биназы. Потенциальные взаимодействия между аминокислотными остатками исследуемых белков и значения псевдоэнергии димеризации определяли с помощью инструмента PPCheck [22]. Отбирали модели с наиболее низкими значениями псевдоэнергии, отражающими наибольшую вероятность самопроизвольного образования белок-белкового комплекса. Визуализацию гетеродимеров выполняли в программе Swiss-PdbViewer.

Статистическая обработка результатов

Эксперименты проводили в трёх технических и трёх биологических повторностях. Для статистической обработки результатов использовали программный пакет Prism 10 (GraphPad, США). Данные представляли в виде средних значений (M) со стандартным отклонением (SD). Статистическую значимость различий значений между группами оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA и post-hoc теста Тьюкки. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Антипролиферативный потенциал биназы и её мутантных форм

Для оценки антипролиферативного потенциала биназы и её мутантных форм опухолевые клетки А431 обрабатывали РНКазами в течение 48 ч в концентрации 300 мкг/мл. Для подтверждения EGFR-опосредованной цитотоксичности РНКаз проводили комбинированную и ступенчатую обработку клеток А431 исследуемыми ферментами и известным анти-EGFR-агентом цетуксимабом в концентрации 100 мкг/мл.

Показано, что РНКазы снижают жизнеспособность клеток примерно на 40%, их комбинация с цетуксимабом не приводит к усилению противоопухолевого эффекта. Блокировка EGFR цетуксимабом не оказывает значимого влияния на цитотоксичность биназы, но снижает пролиферативную активность клеток под действием мутантов К26А и Н101Е на 20 и 10% соответственно (рис. 1, a), что обусловлено элиминацией EGFR с клеточной мембраны (рис. 1, b).

 

Рис. 1. Влияние цетуксимаба на цитотоксичность биназы и её производных по отношению к клеткам А431: a — оценка жизнеспосбности клеток, обработанных биназой, мутантами К26А и Н101Е, при совместной (+цетуксимаб) или предварительной (цетуксимаб/) обработке цетуксимабом. Жизнеспособность необработанных клеток принята за 100%; ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001; b — детекция рецептора эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) в клетках, обработанных цетуксимабом, в течение 24 ч. Контроль — клетки без обработки. Красное окрашивание — EGFR, синее — ядра клеток. Бар 10 мкм.

Fig. 1. Effect of cetuximab on the cytotoxicity of binase and its derivatives against A431 cells: a, assessment of cell viability after treatment with binase and K26A and H101E mutants, either simultaneously with cetuximab (+cetuximab) or after pretreatment with cetuximab (cetuximab/). Viability of untreated cells was set as 100%; ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001; b, epidermal growth factor receptor (EGFR) detection in cells treated with cetuximab for 24 hours. Control: untreated cells. Red staining, EGFR; blue staining, cell nuclei. Scale bar = 10 μm.

 

Таким образом, при снижении каталитической активности доминирующую роль для проявления антипролиферативного эффекта играет способность мутантов взаимодействовать с рецептором.

Оценка способности биназы и её мутантных форм взаимодействовать с EGFR

Для оценки способности мутантов биназы со сниженной каталитической активностью взаимодействовать с EGFR проведён иммунофлуоресцентный анализ на линии клеток А431 эпидермоидной карциномы, характеризующейся высоким уровнем экспрессии EGFR. Опухолевые клетки обрабатывали биназой и её мутантными производными в концентрации 100 мкг/мл в течение 24 ч. Установлено, что биназа спустя 5 мин инкубации находится в приядерной зоне, а на 15-й минуте визуализируется в ядре; выход фермента в цитоплазму регистрируется на 6-й час. При этом на начальном этапе инкубации (5 мин) биназа колокализуется с EGFR на клеточной мембране (приложение 1, a). Взаимодействие РНКазы с рецептором запускает его интернализацию (15 мин), спустя час EGFR частично визуализируется вокруг ядра, а его рециркуляция на мембрану происходит на 6-й час. В это же время вновь детектируется колокализация биназы и EGFR на мембране (см. приложение 1, a).

Локализация мутантов биназы К26А и Н101Е в клетках А431 была аналогичной нативному ферменту (приложение 1, b, c). Колокализация EGFR и РНКаз также детектировалась на мембране на 5-й минуте и на 6-й час инкубации. При этом производные биназы вызывали менее активную интернализацию рецептора, в отличие от природного лиганда EGFR — EGF, обработка клеток которым (100 нг/мл) в течение 30 мин приводила к быстрой интернализации рецептора: EGFR полностью локализовался вокруг ядра (рис. 2).

 

Рис. 2. Иммунофлуоресцентный анализ распределения рецептора эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) в клетках А431, обработанных EGF в дозе 100 нг/мл в течение 30 мин. Контроль — клетки без обработки. Красное окрашивание — EGFR, синее — ядра клеток. Бар 10 мкм.

Fig. 2. Immunofluorescence analysis of epidermal growth factor receptor (EGFR) distribution in A431 cells treated with epidermal growth factor (EGF) 100 ng/mL for 30 minutes. Control: untreated cells. Red staining, EGFR; blue staining, cell nuclei. Scale bar = 10 μm.

 

Характер белок-белковых взаимодействий РНКаз с тирозинкиназным доменом EGFR оценивали с помощью средств молекулярного моделирования. Предсказано, что биназа способна взаимодействовать С-концевым доменом с каталитическим АТФ-связывающим сайтом EGFR за счет ван-дер-ваальсовых сил (рис. 3, a). При этом аминокислотные остатки активного центра биназы и C-конца EGFR могут вступать в электростатическое взаимодействие: H101 — с D1072, а K26 — с E1079 и D1080. Псевдоэнергия образованного гетеродимера составила −306 кДж/моль, что может говорить о самопроизвольном формировании комплекса и высоком сродстве белков друг к другу. Подобное взаимодействие способно подавить активируемое EGF аутофосфорилирование и, как следствие, ингибировать нижестоящие сигнальные каскады.

 

Рис. 3. Трёхмерные модели взаимодействия биназы и её мутантных форм K26A и H101E с тирозинкиназным доменом рецептора эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR): a — гипотетическая модель взаимодействия биназы дикого типа с каталитическим АТФ-связывающим сайтом рецептора, осуществляющим лиганд-индуцируемое фосфорилирование; b и c — гипотетические модели взаимодействия мутантов биназы K26A и Н101Е соответственно с аминокислотными остатками S991 и Y998 EGFR, вовлечёнными в деградацию EGFR. Биназа окрашена синим, мутант биназы К26А — светло-фиолетовым, мутант биназы Н101Е — голубым. EGFR окрашен красным, зелёным выделен каталитический сайт рецептора. Буквенно-числовыми символами отмечены фосфорилируемые аминокислотные остатки EGFR S991, Y998, S1039 и T1041; остатки R671, R675, D1003, E1005, D1008, D1072, E1079 и D1080, вступающие в электростатическое взаимодействие с аминокислотами активного центра биназы в положениях 26 и 101; а также локализация мутаций А26 и E101 в молекуле биназы.

Fig. 3. Three-dimensional models of binase and its mutants K26A and H101E interacting with the tyrosine kinase domain of the epidermal growth factor receptor (EGFR): a, hypothetical model of wild-type binase binding to the catalytic ATP-binding site of the receptor responsible for ligand-induced phosphorylation; b, c, hypothetical models of binase mutants K26A and H101E, respectively, interacting with EGFR amino acid residues S991 and Y998 involved in EGFR degradation. Binase is shown in blue, the K26A mutant in light purple, and the H101E mutant in light blue. EGFR is shown in red, with the catalytic site of the receptor highlighted in green. Alphanumeric labels indicate phosphorylated EGFR amino acid residues S991, Y998, S1039, and T1041; residues R671, R675, D1003, E1005, D1008, D1072, E1079, and D1080 that form electrostatic interactions with the amino acids of the binase active site at positions 26 and 101; and locations of mutations A26 and E101 in the binase molecule.

 

Для мутантной формы биназы K26A связывание с рецептором, вероятно, происходит вблизи остатков S991 и Y998 (рис. 3, b). В образовании контактов могут участвовать как N-концевые, так и C-концевые аминокислотные остатки, при этом взаимодействие имеет преимущественно электростатическую природу. Псевдоэнергия комплекса составила −330 кДж/моль, что отражает высокую устойчивость гетеродимера. Известно, что остатки EGFR S991 и Y998 принимают участие в эндоцитозе рецептора [23] для его последующей убиквитин-зависимой деградации. Следовательно, биназа с мутацией K26A, по всей вероятности, предотвращая фосфорилирование этих остатков, блокирует деградацию рецептора, сохраняя при этом его рециркуляцию. Взаимодействие мутанта биназы H101E с рецептором может происходить аналогичным образом (рис. 3, с), однако стыковка будет осуществляться за счёт электростатических и ван-дер-ваальсовых сил преимущественно в N-концевой области РНКазы. Псевдоэнергия образованного комплекса (−322 кДж/моль) указывает на высокую степень сродства мутанта Н101Е к рецептору.

Оценка способности биназы и её мутантных форм модулировать MAPK-каскад

Несмотря на способность РНКаз и EGF взаимодействовать с EGFR, их влияние на модуляцию МАРК-каскада различается. Для оценки влияния РНКаз на активацию киназы ERK1/2 клетки А431 последовательно обрабатывали биназой и её производными в течение 5 мин, 15 мин и 1 ч, а затем EGF — в течение 30 мин. Показано, что EGF вызывает активацию пути MAPK/ERK, что подтверждается детекцией фосфорилированной формы киназы ERK1/2 через 30 мин инкубации (рис. 4). Предварительная обработка клеток РНКазами снижает уровень фосфорилирования киназы ERK1/2, блокируя EGF-опосредованную трансдукцию сигнала, при этом максимальное ингибирование регистрировалось через 15 мин инкубации (см. рис. 4). Обработка клеток моноклональным антителом против EGFR цетуксимабом в течение 1 ч приводила к полному блокированию активации киназы ERK (см. рис. 4).

 

Рис. 4. Иммунофлуоресцентный анализ уровня фосфорилирования киназы ERK1/2 в клетках А431 после обработки биназой, мутантными формами К26А и Н101Е в дозе 100 мкг/мл в течение 5 и 15 мин, эпидермальным фактором роста (growth factor receptor, EGF) в дозе 100 нг/мл в течение 30 мин и цетуксимабом в дозе 100 мкг/мл в течение 60 мин. Контроль — клетки без обработки. Бар 10 мкм.

Fig. 4. Immunofluorescence analysis of ERK1/2 phosphorylation in A431 cells after treatment with binase and its mutants K26A and H101E (100 μg/mL, 5 and 15 minutes), epidermal growth factor (EGF, 100 ng/mL, 30 minutes), and cetuximab (100 μg/mL, 60 minutes). Control: untreated cells. Scale bar = 10 μm.

 

Оценка антимиграционной активности биназы и её мутантных форм

Оценку антимиграционной активности биназы и её мутантов проводили в тесте на зарастание царапины. Клетки обрабатывали РНКазами в нетоксичных концентрациях 10, 50 и 100 мкг/мл, что было подтверждено в МТТ-тесте (рис. 5, b). Показано, что биназа через 48 ч инкубации в концентрации 10 мкг/мл снижает миграционную активность клеток А431 на 40%, в концентрациях 50 и 100 мкг/мл — на 50% (рис. 5, a, d). Мутант биназы K26A проявлял свой антимиграционный потенциал во всех исследуемых концентрациях, снижая скорость миграции клеток на 30% (см. рис. 5, a, d). При этом мутант биназы Н101Е не обладал способностью блокировать миграцию опухолевых клеток А431.

 

Рис. 5. Влияние биназы и мутантных форм К26А и Н101Е на миграцию и жизнеспособность клеток А431: a — зарастание царапины в монослое клеток А431, культивируемых в присутствии РНКаз в диапазоне концентраций 0–100 мкг/мл в течение 48 ч. Точками обозначены границы изначального повреждения монослоя, сплошными линиями — границы монослоя после инкубации с РНКазами; ×200; b — жизнеспособность клеток А431, обработанных РНКазами в течение 48 ч; с и d — степень зарастания царапины после обработки РНКазами в течение 24 и 48 ч соответственно; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

Fig. 5. Effect of binase and its mutants K26A and H101E on migration and viability of A431 cells: a, scratch closure in A431 cell monolayers cultured with RNases at concentrations of 0–100 μg/mL for 48 hours. Dotted lines indicate the boundaries of the initial scratch in the monolayer; solid lines indicate the monolayer boundaries after incubation with RNases; ×200; b, viability of A431 cells treated with RNases for 48 hours; c and d, degree of scratch closure after RNase treatment for 24 hours and 48 hours, respectively; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Среди представителей семейства рецепторных тирозинкиназ ErbB наиболее изучен EGFR. Он регулирует сигнальные пути, отвечающие за пролиферацию, дифференцировку, миграцию, выживаемость и апоптоз клеток. Нарушение EGFR-опосредованного сигналинга является одной из наиболее частых причин развития злокачественной трансформации клеток [24], в связи с чем EGFR представляет собой привлекательную мишень для разработки таргетных препаратов в противоопухолевой терапии. Так, первые анти-EGFR-препараты — моноклональные антитела цетуксимаб и панитумумаб — были созданы для лечения метастатического колоректального рака, экспрессирующего EGFR дикого типа, однако их эффективность значительно снижается при возникновении мутаций во внеклеточном домене рецептора и нижележащих компонентах путей [25, 26]. Для преодоления данной проблемы были разработаны малые ингибиторы тирозинкиназ, активных в отношении EGFR с мутациями ex19del и ex21 (L858R). При этом возникновение мутаций EGFR T790M/C797S ограничивает применение подавляющего большинства ингибиторов тирозинкиназ [27]. В связи с этим проблема разработки альтернативных терапевтических стратегий и поиска новых анти-EGFR-агентов стоит наиболее остро.

Ранее было показано, что РНКаза B. pumilus (биназа) способна взаимодействовать с EGFR в клетках трижды-негативного рака молочной железы ВТ-20, что приводило к блокированию МАРК-каскада и гибели опухолевых клеток [15]. Для уменьшения нефро- и генотоксичности биназы были получены её мутантные формы K26A и H101E со сниженной каталитической активностью, цитотоксический потенциал которых варьировал в зависимости от линии опухолевых клеток [10, 11]. Так, показано, что мутант биназы H101E в отличие от K26A не обладает антипролиферативным потенциалом по отношению к линиям клеток аденокарциномы лёгких А549, аденокарциномы двенадцатиперстной кишки HuTu80, трижды-негативного рака молочной железы BT-20 [9]. Нами обнаружено, что оба мутанта проявляют схожее с нативным ферментом цитотоксическое действие в отношении клеток эпидермоидной карциномы А431, характеризующихся гиперэкспрессией EGFR дикого типа (см. рис. 1, a). Мы предположили, что EGFR также является мишенью цитотоксического действия мутантных РНКаз.

Методом иммунофлуоресцентного анализа было подтверждено, что биназа и её производные способны взаимодействовать с EGFR в клетках А431 (см. приложение 1). РНКазы уже на первой минуте инкубации проникают и полностью распределяются внутри клетки, при этом их взаимодействие с рецептором не регистрируется. Колокализация с EGFR детектируется на мембране лишь на 5-й минуте (см. приложение 1). Вероятно, РНКазы взаимодействуют с внутриклеточным тирозинкиназным доменом рецептора, что вызывает его интернализацию. В случае мутантных форм биназы трафик EGFR внутрь клетки происходит менее активно по сравнению с биназой дикого типа (см. приложение 1). В ходе молекулярного моделирования предсказано, что биназа способна полностью закрывать АТФ-связывающий карман тирозинкиназного домена EGFR, в то время как мутантные формы, вероятно, блокируют области, отвечающие за эндоцитоз рецептора, что может объяснить менее активную интернализацию EGFR после обработки мутантными РНКазами (см. рис. 3). Связывание РНКаз с рецептором приводит к снижению уровня фосфорилирования ERK и ингибированию сигналинга МАРК-ERK (см. рис. 4). Подобное действие схоже с активностью обратимых ингибиторов тирозинкиназ, блокирующих аутофосфорилирование рецептора и последующую передачу сигнала, а также вызывающих интернализацию рецептора [28]. Роль EGFR как мишени противоопухолевого действия мутантов биназы была подтверждена в МТТ-тесте с использованием моноклонального анти-EGFR антитела цетуксимаба. Показано, что предобработка клеток цетуксимабом в течение 24 ч приводит к исчезновению флуоресцентного сигнала EGFR (см. рис. 1, b), и это свидетельствует о его деградации [29]. Элиминация EGFR с поверхности клеток ослабляет антипролиферативный эффект мутантных РНКаз, практически полностью нивелируя цитотоксичность каталитически неактивного мутанта биназы H101E (см. рис. 1, a).

Известно, что процессы миграции и инвазии злокачественных клеток регулируются сигнальными каскадами МАРК/ERK и Р13К/АКТ, находящимися под контролем EGFR [30]. При этом оценка антимиграционной активности РНКаз показала, что биназа обладает наиболее выраженным антиметастатическим эффектом среди исследуемых РНКаз, а мутант Н101Е не способен блокировать миграционную активность опухолевых клеток. Вероятно, антиметастатический потенциал исследуемых РНКаз обусловлен в первую очередь их каталитической активностью. При гидролизе внутриклеточной РНК каталитически активными РНКазами могут образовываться малые интерферирующие РНК (миРНК), способные включаться в процессы посттранскрипционной регуляции экспрессии генов и влиять на миграцию опухолевых клеток. Ранее было показано, что биназа снижает уровень экспрессии онкогенных миРНК миР-21a, миР-10b, миР-155a, миР-31 в сыворотке крови ксенографтных моделей мышей с лимфосаркомой RLS₄₀ [31]. При этом активирующая роль в процессах инвазии и метастазирования опухолевых клеток доказана для миР-21а и миР-31 [32].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе охарактеризована способность мутантов биназы со сниженной каталитической активностью взаимодействовать с EGFR, а также оценён вклад этого взаимодействия в антипролиферативное и антиметастатическое действие РНКаз. Установлено, что оба мутанта биназы, так же, как и нативный фермент, проявляют цитотоксические свойства в отношении линии клеток А431 эпидермоидной карциномы, характеризующейся высоким уровнем экспрессии EGFR. Показано, что их цитотоксичность обусловлена способностью белков взаимодействовать с EGFR. Блокирование сайта связывания мутантов с EGFR моноклональным антителом цетуксимабом приводило к снижению цитотоксического потенциала мутантных производных биназы, в особенности каталитически неактивного варианта H101E. Связывание РНКаз с рецептором, вероятно, происходит в области тирозин-киназного домена EGFR, вызывая его медленную интернализацию и блокирование активации нижестоящего компонента MAPK-каскада — киназы ERK1/2, что приводит к ингибированию передачи сигнала и гибели опухолевых клеток. Оценка способности мутантов биназы ингибировать метастазирование опухолевых клеток показала, что мутант H101E не обладает антиметастатическими свойствами ввиду отсутствия необходимого уровня каталитической активности.

Таким образом, установлено, что цитотоксичность мутантных форм биназы обусловлена их взаимодействием с EGFR, которое приводит к блокированию сигналинга МАРК/ERK и гибели опухолевых клеток. При этом доказана важность каталитической активности для проявления антиметастатического потенциала РНКаз. Особенно перспективной представляется разработка противоопухолевых препаратов на основе мутанта биназы К26А, обладающего схожим с нативным ферментом противоопухолевым эффектом, но с меньшей гено- и нефротоксичностью.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. А.И. Надырова — обзор и анализ литературных источников, участие в проведение экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка статьи к публикации; Е.В. Дудкина — участие в проведение экспериментов, обработка и анализ полученных результатов, подготовка статьи к публикации; Э.М. Хафизова, А.Д. Пестов — участие в проведении экспериментов; А.С. Коснырев — участие в проведении экспериментов, подготовка статьи к публикации; В.В. Ульянова, О.Н. Ильинская — общее руководство, подготовка статьи к публикации. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Авторы выражают благодарность доктору биологических наук, заведующему кафедрой генетики Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета А.Р. Каюмову за предоставленную возможность работы на инвертированном конфокальном микроскопе Olympus IX83.

Этическая экспертиза. Неприменимо.

Согласие на публикацию. Неприменимо.

Источники финансирования. Работа выполнена за счёт предоставленного в 2024 году Академией наук Республики Татарстан гранта на осуществление фундаментальных и прикладных научных работ в научных и образовательных организациях, предприятиях и организациях реального сектора экономики Республики Татарстан.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье и приложении к ней.

Приложение 1. Иммунофлуореcцентный анализ взаимодействия биназы (a) и её мутантных форм К26А (b) и Н101Е (c) с рецептором эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) в опухолевых клетках А431 после обработки РНКазами в течение 1 мин, 5 мин, 15 мин, 1 ч и 6 ч. DOI: 10.17816/gc687285-4377350.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, один член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: A.I. Nadyrova: investigation, formal analysis, writing — original draft, writing — review & editing; E.V. Dudkina: investigation, formal analysis, writing — original draft, writing — review & editing; E.M. Khafizova, A.D. Pestov: investigation; A.S. Kosnyrev: investigation, writing — original draft, writing — review & editing; V.V. Ulyanova, O.N. Ilinskaya: supervision, writing — original draft, writing — review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgments: The authors express their gratitude to Dr. A.R. Kayumov, Doctor of Sciences in Biology, Head of the Department of Genetics at the Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, for providing access to the inverted confocal microscope (Olympus IX83).

Ethics approval: Not applicable.

Consent for publication: Not applicable.

Funding sources: This work was supported by a 2024 grant from the Academy of Sciences of the Republic of Tatarstan for conducting fundamental and applied research in scientific and educational institutions, enterprises, and organizations of the real economy of the Republic of Tatarstan.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality. No previously published material (text, images, or data) was used in this work.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data generated during this study are available in the article and its supplementary material.

Supplement 1. Immunofluorescence analysis of the interaction of binase (a) and its mutants K26A (b) and H101E (c) with the epidermal growth factor receptor (EGFR) in A431 tumor cells after RNase treatment for 1 minute, 5 minutes, 15 minutes, 1 hour, and 6 hours. DOI: 10.17816/gc687285-4377350.

Generative AI. No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The review process involved two external reviewers, one member of the editorial board, and the in-house scientific editor.

About the authors

Alsu I. Nadyrova

Kazan (Volga Region) Federal University

Author for correspondence.
Email: alsu.nadyrova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1312-0605
SPIN-code: 9618-7816
Russian Federation, Kazan

Elena V. Dudkina

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: ElVDudkina@kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2817-1384
SPIN-code: 5874-7417

Cand. Sci. (Biology), Associate Professor

Russian Federation, Kazan

Elvira M. Khafizova

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: elvirra.khafizova@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0004-3408-9493
Russian Federation, Kazan

Alexander D. Pestov

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: alexander.p3stov@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0000-5189-8111
Russian Federation, Kazan

Alexander S. Kosnyrev

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: AleSKosnyrev@kpfu.ru
ORCID iD: 0009-0008-4341-5181
SPIN-code: 8593-7837
Russian Federation, Kazan

Vera V. Ulyanova

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: Vera.Uljanova@kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1768-3314
SPIN-code: 8479-4593

Cand. Sci. (Biology), Associate Professor

Russian Federation, Kazan

Olga N. Ilinskaya

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: Olga.Ilinskaya@kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6936-2032
SPIN-code: 7972-5807

Doc. Sci. (Biology), Professor

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files