Properties of osteoplastic matrices based on polylactide microparticles and platelet-rich plasma impregnated with adenoviral constructs carrying BMP2 gene

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Разработка эффективного способа восполнения обширных дефектов костной ткани представляет собой важную задачу в стоматологии, ортопедии и челюстно-лицевой хирургии [1]. Подходы генной терапии позволяют стимулировать естественные процессы регенерации костей. Перспективным является создание ген-активированных остеопластических материалов (ГАМ) — биосовместимых матриц, импрегнированных генетическими конструкциями. Они помогают обеспечить ускоренное заживление костных повреждений за счёт целенаправленной доставки генов белков-остеоиндукторов в резидентные клетки. Это позволяет достичь устойчивой и регулируемой продукции белка, который способствует привлечению в зону дефекта эндотелиальных, иммунных и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), а также индуцирует дифференцировку прогениторных клеток [2, 3].

Остеопластическим материалам необходимо иметь ряд характеристик для успешного заживления костных дефектов. Они должны быть биосовместимыми, биорезорбируемыми, а также обладать остеоиндуктивными свойствами и выступать в качестве каркаса для поддержания роста костной ткани [4]. Матрицы для доставки генетических конструкций могут быть созданы из природных и синтетических полимеров [5]. Полимолочная кислота (polylactic acid, PLA) представляет собой гидрофобный алифатический полиэфир, часто используемый при изготовлении матриксов для биомедицинского применения благодаря биосовместимости, термостабильности и биорезорбируемости [6]. Кроме того, механические свойства матриц на основе PLA могут быть подобраны в соответствии со свойствами костной ткани, а за счёт выбора структуры PLA может достигаться оптимальное время биодеградации каркасов [7, 8]. Таким образом, скорость замещения PLA матриксов может соответствовать времени восстановления костной ткани [9]. Показана эффективность использования матриксов на основе PLA с костным морфогенетическим белком 2 (bone morphogenetic protein 2, BMP2) и генетическими конструкциями, несущими его ген. Такие матриксы способны поддерживать адгезию клеток, стимулировать остеогенную дифференцировку ММСК и неоостеогенез в моделях ортотопического остеогенеза [10–14]. Кроме того, при создании матриксов перспективным компонентом является обогащённая тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma, PRP). При активации PRP образуется фибриновый сгусток, имитирующий гематому, которая является важным элементом регенеративного процесса. Она способствует восстановлению костных дефектов и служит источником необходимых для заживления компонентов, таких как цитокины, факторы роста и ангиогенные факторы [15]. Показано, что использование комбинации PRP с BMP2 или плазмидой с геном BMP2 приводит к увеличению количества кровеносных сосудов, способствует пролиферации прогениторных клеток и ускоряет заживление костных дефектов [16–18]. Помимо этого, фибриновые сгустки, которые образуются в результате полимеризации фибриногена из PRP, можно использовать для формирования плотных каркасов, позволяющих обеспечить постепенное высвобождение содержимого.

Для придания остеоиндуктивных свойств к материалам для костной пластики могут быть добавлены факторы роста, которые участвуют в регуляции остеогенной дифференцировки. Одним из наиболее изученных и часто используемых индукторов остеогенеза является белок BMP2 [19], который способен инициировать формирование костной ткани, преимущественно путём рекрутирования и стимуляции дифференцировки клеток-предшественников остеобластного дифферона [20]. Применение рекомбинантного BMP2 в составе матриц увеличивало образование кости в различных моделях дефектов костей животных [21–24]. Однако быстрая деградация белка в организме требует его использования в высоких концентрациях, что может приводить к нежелательным последствиям, ограничивая клиническое применение BMP2 [25, 26]. Многообещающей альтернативой белку BMP2 является доставка гена BMP2 с помощью вирусных или невирусных конструкций в составе матриц, что обеспечивает локальную продукцию белка резидентными клетками в физиологических концентрациях. В отличие от невирусных способов доставки вирусные векторы позволяют добиться более эффективного переноса целевых генов в клетки-мишени [27]. В медицинской практике применяются аденовирусные векторы, которые могут трансдуцировать делящиеся и неделящиеся клетки. При этом ДНК не встраивается в геном клетки-хозяина, что минимизирует вероятность возникновения инсерционного мутагенеза [28]. Таким образом, конструирование ГАМ с использованием аденовирусных конструкций является перспективным и целесообразным подходом для лечения пациентов с дефектами костей.

ЦЕЛЬ

Разработка ГАМ на основе микрочастиц PLA и PRP, импрегнированных аденовирусными конструкциями с геном BMP2, и исследование их свойств.

МЕТОДЫ

Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани крыс

Культуры ММСК были ранее получены из жировой ткани (ЖТ) крыс в лаборатории генетики стволовых клеток ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» и охарактеризованы [29]. Клетки культивировали при 37 °C и 5% CO₂ в ростовой среде на основе DMEM/F12 («ПанЭко», Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; BioWest, Франция); 0,584 мг/мл L-глутамина («ПанЭко», Россия); 5000 ЕД/мл пенициллина и 5000 мг/мл стрептомицина («ПанЭко», Россия). Каждые три дня производили замену среды на свежую.

В ходе экспериментов in vitro ММСК ЖТ в плотности 50 × 10³ кл./мл высевали на дно 24-луночных планшетов, а матриксы помещали в подвесные вкладыши Transwell (SPL Life Sciences, Южная Корея). Замену половины среды проводили каждые три дня.

Определение оптимальной концентрации аденовирусной ДНК для эффективной трансдукции мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани крыс

В течение 24 ч ММСК ЖТ инкубировали совместно с суспензией аденовирусных векторов с геном gfp в концентрациях 10, 50 и 100 нг/мкл вирусной ДНК в вышеописанной среде DMEM/F12 с L-глутамином и антибиотиками, а также с добавлением 2% ЭТС. После этого клетки отмывали от вирусных конструкций. Эффективность трансдукции клеток на 1-е и 3-и сутки определяли по наличию клеток, продуцирующих зелёный флуоресцентный белок, с помощью автоматизированного имиджера Lionheart FX (BioTek, США), а также методом проточной цитофлуориметрии с использованием цитометра CyFlow ML (Partec, Япония).

Получение ген-активированных матриксов

Пористые микрочастицы PLA диаметром 0,1–0,4 мм, полученные из поли-L-лактида с молекулярной массой 200 кДа (NatureWorks, США), были изготовлены в отделе нанобиотехнологий НИЦ «Курчатовский институт» методом распыления с заморозкой и последующей сублимационной сушкой. Диаметр пор микрочастиц PLA составлял 2–10 мкм [30]. Микрочастицы стерилизовали в течение 30 мин в 70% растворе этанола, а затем отмывали физиологическим раствором на протяжении 1 ч.

Для получения PRP производили забор крови крыс путём сердечной пункции в пробирки с цитратом натрия и центрифугировали при 1100 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Супернатант, в котором находились тромбоциты и лейкоциты, собирали и центрифугировали при 3600 об./мин в течение 15 мин при комнатной температуре. Половину от бедного тромбоцитами супернатанта удаляли, а осадок ресуспендировали в оставшемся объёме.

Аденовирусные частицы с генами BMP2 и gfp были получены в ходе совместной работы с сотрудниками ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» [31]. Вирусные частицы наращивали в клетках HEK-293 из американского банка биоматериалов American Type Culture Collection. С этой целью клетки HEK-293 культивировали в среде DMEM/F12, содержащей 10% ЭТС, 0,584 мг/мл L-глутамина, 5000 ЕД/мл пенициллина и 5000 мг/мл стрептомицина, при 37 °C и 5% CO₂ до достижения 80% конфлюентного монослоя и затем инкубировали с суспензией вирусных частиц в среде, содержащей 2% ЭТС, в течение 48 ч. После этого клетки разрушали путём трёхкратного замораживания (до −80 °C) и оттаивания (до 37 °C). Затем выделяли вирусную ДНК с помощью набора QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя и измеряли концентрацию с помощью спектрофотометра NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США).

Получали ГАМ посредством инкубации 100 мкл микрочастиц PLA с аденовирусными конструкциями Ad-BMP2 или Ad-GFP с концентрацией вирусной ДНК 50 мкг/мл в течение 24 ч при 37 °C. Затем ГАМ смешивали с 80 мкл PRP и добавляли 20 мкл раствора тромбина (PZ Cormay, Польша) в 10% растворе хлорида кальция (НПО «Микроген», Россия) для полимеризации фибриногена. В результате формировался фибриновый сгусток, который соединял все компоненты матриксов.

Сканирующая электронная микроскопия

Для изучения структуры матриксов на основе микрочастиц PLA с PRP их фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида (Panreac, США) в течение 12 ч при 4 °C. Далее образцы промывали фосфатно-солевым буфером («ПанЭко», Россия) и проводили дегидратацию в батарее этанола с возрастающей концентрацией (50% → 75% → 80% → 90%) с последующей обработкой абсолютным этанолом; все этапы выполняли при 4 °C. После образцы высушивали на воздухе, фиксировали на сменном предметном столике электронного микроскопа при помощи углеродной токопроводящей клейкой ленты и без дополнительной обработки исследовали на сканирующем электронном микроскопе Phenom ProX (Thermo Fisher Scientific, США) при ускоряющем напряжении 15 кВ и при низком вакууме, режим Topo с детектором SE.

Выделение вирусной ДНК и оценка кинетики высвобождения

Для оценки кинетики высвобождения аденовирусных конструкций из матриксов PLA/PRP-Ad-GFP и PLA/Ad-GFP их инкубировали в физиологическом растворе («ПанЭко», Россия) в течение 15 дней и измеряли концентрацию вирусной ДНК в физиологическом растворе каждые 3 сут. Выделение вирусной ДНК проводили с помощью набора QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя. Концентрацию ДНК оценивали при длине волны 260 нм с помощью спектрофотометра NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific, США).

Трансдуцирующая способность аденовирусных конструкций в составе ген-активированных матриксов

Предварительно окрашенные PKH-26 ММСК ЖТ (Sigma-Aldrich, США) инкубировали с вирусными конструкциями Ad-GFP и с матриксами PLA/PRP и PLA/PRP-Ad-GFP в течение 7 дней. Инкубацию клеток с Ad-GFP проводили в течение 24 ч, после чего производили отмывку вирусной суспензии и далее культивировали клетки в ростовой среде. Матриксы инкубировали с клетками на протяжении всего срока исследования. Эффективность трансдуцирующей способности Ad-GFP оценивали с помощью автоматизированного имиджера Lionheart FX (BioTek, США), а также путём исследования относительного уровня экспрессии гена gfp клетками на 1-е и 7-е сутки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Матричную РНК выделяли из клеток с помощью набора RNeasy Plus Mini kit (QIAGEN, Германия), а затем синтезировали комплементарную ДНК с помощью фермента RevertAid (Thermo Scientific, США) по протоколам производителя. После проводили ПЦР-РВ в термоциклере iCycler iQ (Bio-Rad, США), используя интеркалирующий краситель SYBR Green I («Евроген», Россия). Уровень экспрессии целевых генов был нормализирован по значению экспрессии генов «домашнего хозяйства» Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gapdh) и Actin-β (Actβ). Последовательность используемых в работе праймеров представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Последовательность праймеров для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Table 1. Sequence of primers for real-time polymerase chain reaction

Ген	Последовательность нуклеотидов
Actβ	forward GAGATTACTGCCCTGGCTCC reverse GCTCAGTAACAGTCCGCCTA
Alpl	forward TGCCTACTTGTGTGGCGTGA reverse CGTGACCTCGTTCCCCTGAG
Bglap	forward CCTAGCAGACACCATGAGGAC reverse CAGGTCAGAGAGGCAGAATGC
Gapdh	forward GCGAGATCCCGCTAACATCA reverse CCCTTCCACGATGCCAAAGT
gfp	forward ACGTAAACGGCCACAAGTTCA reverse CTGCCGTCCTCGATGTTGT
Spp1	forward GACGATGACGACGGAGACC reverse TGGCAGTGAAGGACTCATCA

 

Оценка цитотоксичности матриксов

Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста через 1 и 7 сут. С этой целью клетки инкубировали в течение 2 ч с 0,5 мг/мл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия («ПанЭко», Россия) при 37 °С. Кристаллы формазана растворяли диметилсульфоксидом («ПанЭко», Россия), перемешивая на шейкере в течение 20 мин. Оптическую плотность раствора измеряли на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 570 нм, фоновое значение вычитали при 620 нм. Данные приведены относительно значений в контрольных лунках без добавления матриксов, которые были приняты за 100%.

Внутримышечная имплантация матриксов крысам

Исследования in vivo проводили на крысах линии Wistar массой 250–300 г. В каждой экспериментальной группе было по 6 животных. В качестве анестезии крысам вводили внутримышечно тилетамин + золазепам¹ (Virbac, Франция) и ксилазин (Interchemie Werken De Adelaar BV, Нидерланды) в дозах 30 и 5 мг/кг соответственно. Исследуемые матриксы имплантировали в двуглавую мышцу бедра крыс. Рану зашивали, используя материал викрил 5/0 (Ethicon, США). Через 28 сут после операции всех крыс усыпляли ингаляцией CO₂ и осуществляли резекцию участков имплантации.

Для проведения гистологического исследования образцы фиксировали 10% нейтральным забуференным раствором формалина («Лабико», Россия) в течение не менее 24 ч и заливали в парафин. После чего получали срезы толщиной 5–10 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином и с помощью микроскопа Аxio Observer D1 с камерой AxioCam HRc Axioimager M.1 (Carl Zeiss, Германия) делали фотографии гистологических срезов, по которым оценивали биосовместимость матриксов. Для оценки соотношения количества гигантских многоядерных клеток инородных тел к площади среза в поле зрения (на 1 мм²) было проанализировано 20 полей.

Остеогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани

Для исследования остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ клетки культивировали в присутствии ГАМ в остеогенной среде на основе ростовой среды с добавлением 0,05 мг/мл L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, США) и 2,16 мг/мл β-глицерофосфата натрия (Sigma-Aldrich, США). Эффективность оценивали по изменению уровня экспрессии генов остеогенных маркёров (Spp1, Bglap и Alpl) [32], активности щелочной фосфатазы (Alpl) и минерализации внеклеточного матрикса ММСК ЖТ.

Активность Alpl определяли в клеточных лизатах с использованием набора для количественной оценки активности щелочной фосфатазы (Elabscience Biotechnology, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Измерения проводили на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США).

Для оценки минерализации внеклеточного матрикса после отмывки клеток фосфатно-солевым буферным раствором («ПанЭко», Россия) ММСК ЖТ фиксировали охлаждённым 70% этанолом в течение 30 мин при +4 °С. Затем клетки окрашивали 2% водным раствором ализаринового красного с pH 4,1 (Sigma-Aldrich, США) в течение 5 мин. Для удаления несвязавшегося красителя производили двукратную отмывку дистиллированной водой. Получали изображения с помощью микроскопа Аxio Observer D1 с камерой AxioCam HRc Axioimager M.1 (Carl Zeiss, Германия).

Статистический анализ

В каждом эксперименте использовали не менее 4 биологических повторов и результаты представляли в виде M ± SD. Построение графиков и статистический анализ выполняли в программах Excel и SigmaPlot 12.0 (Systat Software, Германия). Межгрупповые различия статистически анализировали с помощью теста Холма–Сидака после однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).

РЕЗУЛЬТАТЫ

При инкубации ММСК ЖТ с Ad-GFP наблюдали увеличение количества трансдуцированных клеток при возрастании концентрации вирусной ДНК (рис. 1). Однако не выявлено статистически значимых различий значений данного показателя между группами клеток, культивируемых с 50 и 100 нг/мкл Ad-GFP как на 1-е, так и на 3-и сутки. Инкубация ММСК ЖТ с 50 и 100 нг/мкл Ad-GFP через 3 сут приводила к трансдукции (75,8 ± 5,7)% и (80,4 ± 4,4)% клеток соответственно. На основании полученных данных для последующих экспериментов была выбрана концентрация 50 нг/мкл вирусной ДНК, обеспечивающая высокую эффективность трансдукции при минимальной вирусной нагрузке.

 

Рис. 1. Трансдукция мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани Ad-GFP в различных концентрациях на 1-е и 3-и сутки после инкубации: a — визуализация клеток (фазово-контрастная) и трансдуцированных клеток по накоплению белка GFP (зелёное окрашивание, флуоресцентная микроскопия); b — относительное количество трансдуцированных клеток, проточная цитофлуориметрия; * p < 0,05 (по сравнению с 10 нг/мкл Ad-GFP).

Fig. 1. Transduction of adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells with Ad-GFP at various concentrations on days 1 and 3 after incubation: a, visualization of cells (phase-contrast) and transduced cells based on GFP protein accumulation (green staining, fluorescence microscopy); b, relative number of transduced cells, flow cytometry; * p < 0.05 compared with 10 ng/μL Ad-GFP.

 

Были получены ГАМ на основе микрочастиц PLA и гидрогеля PRP в соотношении 1:1, содержащие Ad-BMP2 или Ad-GFP с концентрацией вирусной ДНК 50 нг/мкл (рис. 2, a). С помощью сканирующей электронной микроскопии показана детальная структура матриксов (рис. 2, b, c). Микрочастицы PLA имеют сферическую форму, хорошо видна их высокопористая поверхность. Гидрогель PRP образует аморфную матрицу, окружающую частицы PLA, обеспечивая их механическую фиксацию.

 

Рис. 2. Ген-активированные остеопластические материалы на основе микрочастиц полимолочной кислоты (polylactic acid, PLA) и обогащённой тромбоцитами плазмы (platelet-rich plasma, PRP), импрегнированные Ad-BMP2: a — внешний вид PLA/PRP-Ad-BMP2; b — структура микрочастиц PLA; c — PLA/PRP; сканирующая электронная микроскопия, 1000× (b) и 500× (c).

Fig. 2. Gene-activated osteoplastic materials based on polylactic acid (PLA) microparticles and platelet-rich plasma (PRP) impregnated with Ad-BMP2: a, appearance of PLA/PRP–Ad-BMP2; b, structure of PLA microparticles; c, PLA/PRP; scanning electron microscopy, ×1000 (b) and ×500 (c).

 

Изучение кинетики высвобождения вирусных конструкций из матриксов на основе PLA/PRP в сравнении с микрочастицами PLA показало, что аденовирусные конструкции с геном gfp высвобождались из матриксов постепенно, но с различной скоростью (рис. 3). Из матриксов на основе микрочастиц PLA уже на 1-е сутки высвободилось 55% Ad-GFP, а к 15-му дню это значение достигло 87%. Выход вирусных векторов из матриксов на основе PLA/PRP происходил медленнее. На 1-е сутки высвободилось 27% Ad-GFP, а через 2 нед было выявлено только 51% вирусных частиц. Таким образом, матриксы на основе микрочастиц PLA с добавлением гидрогеля обеспечивают более пролонгированное высвобождение генетических конструкций.

 

Рис. 3. Кинетика высвобождения Ad-GFP из матриксов, спектрофотометрия.

Fig. 3. Kinetics of Ad-GFP release from matrices, spectrophotometry.

 

По наличию ММСК ЖТ, продуцирующих белок GFP, была подтверждена трансдуцирующая способность Ad-GFP, высвобождающихся из матриксов PLA/PRP (рис. 4, a). Уже на 1-е сутки после инкубации матриксов PLA/PRP-Ad-GFP в отдельных клетках отмечено наличие флуоресцентного белка, к 7-м суткам число клеток, продуцирующих GFP, увеличивалось. Данные подтверждаются также уровнем экспрессии гена gfp в ММСК ЖТ, который увеличивался в 17 раз на 7-е сутки после инкубации клеток с матриксами PLA/PRP-Ad-GFP по сравнению с 1-ми сутками (рис. 4, b). Значительно эффективнее происходила трансдукция ММСК ЖТ Ad-GFP без матриксов. А клетки из контрольных образцов и после инкубации с матриксами PLA/PRP не синтезировали GFP.

 

Рис. 4. Трансдукция мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани Ad-GFP после 1 и 7 сут инкубации с матриксами PLA/PRP [PLA — полимолочная кислота (polylactic acid), PRP — обогащённая тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma)]: a — визуализация клеток с помощью красителя PKH26 (красный цвет) и трансдуцированных клеток по накоплению белка GFP (зелёный цвет), флуоресцентная микроскопия; b — относительный уровень экспрессии гена gfp в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках жировой ткани, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени; * p < 0,05 (по сравнению с Ad-GFP). Бар 100 мкм.

Fig. 4. Transduction of adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells with Ad-GFP after 1 and 7 days of incubation with PLA/PRP matrices (PLA, polylactic acid; PRP, platelet-rich plasma): a, visualization of cells stained with PKH26 (red) and transduced cells showing GFP protein accumulation (green), fluorescence microscopy; b, relative expression level of the gfp gene in adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells, real-time polymerase chain reaction; * p < 0.05 compared with Ad-GFP. Scale bar 100 µm.

 

С помощью МТТ-теста установлено, что матриксы PLA/PRP и PLA/PRP, импрегнированные Ad-BMP2, не оказывают цитотоксического действия на ММСК ЖТ через 1 и 7 сут после инкубации (рис. 5). При этом число жизнеспособных клеток через 7 сут инкубации ММСК ЖТ в присутствии матриксов PLA/PRP и PLA/PRP-Ad-BMP2 статистически значимо превышало данный показатель для контрольных клеток без матриксов.

 

Рис. 5. Относительное количество живых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани через 1 и 7 сут после инкубации с матриксами PLA/PRP и PLA/PRP, импрегнированными Ad-BMP2, МТТ-тест; * p < 0,05 (по сравнению с контролем). PLA — полимолочная кислота (polylactic acid), PRP — обогащённая тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma).

Fig. 5. Relative number of viable adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells after 1 and 7 days of incubation with PLA/PRP matrices and PLA/PRP matrices impregnated with Ad-BMP2, MTT assay; * p < 0.05 compared with control. PLA, polylactic acid; PRP, platelet-rich plasma.

 

Через 28 сут после внутримышечной имплантации исследуемых матриксов наблюдалось образование грануляционной ткани с молодыми фибробластами и сосудами (рис. 6). Микрочастицы PLA были окружены гигантскими многоядерными клетками инородных тел. Не выявлено экссудативной воспалительной реакции.

 

Рис. 6. Область имплантации через 28 сут после внутримышечного введения матриксов: PLA/PRP (a), PLA/PRP-Ad-BMP2 (b). Окраска гематоксилином и эозином, световая микроскопия. КС — кровеносные сосуды, ГК — гигантские многоядерные клетки инородных тел, PLA — полимолочная кислота (polylactic acid), PRP — обогащённая тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma).

Fig. 6. Implantation site 28 days after intramuscular administration of matrices: PLA/PRP (a), PLA/PRP–Ad-BMP2 (b). Hematoxylin-eosin staining, light microscopy. КС, blood vessels; ГК, foreign body multinucleated giant cells; PLA, polylactic acid; PRP, platelet-rich plasma.

 

Проведена также оценка количества гигантских многоядерных клеток инородных тел после внутримышечной имплантации матриксов (рис. 7). Данные свидетельствуют о том, что добавление аденовирусных конструкций к PLA/PRP не оказывает значительного влияния на степень их резорбции. Наблюдаемая реакция соответствовала физиологическому ответу на имплантацию, что говорит о хорошей биосовместимости разработанных материалов.

 

Рис. 7. Количество гигантских многоядерных клеток инородных тел после имплантации через 28 сут, гистоморфометрический анализ. PLA — полимолочная кислота (polylactic acid), PRP — обогащённая тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma).

Fig. 7. Number of foreign body multinucleated giant cells 28 days after implantation, histomorphometric analysis. PLA, polylactic acid; PRP, platelet-rich plasma.

 

На 14-е сутки после инкубации ММСК ЖТ с матриксами PLA/PRP-Ad-BMP2 обнаружено увеличение уровня экспрессии генов маркёров остеогенной дифференцировки Bglap, Spp1 и Alpl в 5,3 и 6 раз по сравнению с контрольной группой (рис. 8, a). Активность щелочной фосфатазы также возрастала в исследуемой группе в 2 раза. Кроме того, при инкубации ММСК ЖТ с ГАМ PLA/PRP-Ad-BMP2 были обнаружены минеральные отложения во внеклеточном матриксе, чего не наблюдалось в контрольной группе и группе клеток, культивируемых с материалами PLA/PRP без генетических конструкций (рис. 8, b). Эти данные свидетельствуют о том, что ГАМ имеют остеоиндуктивные свойства in vitro.

 

Рис. 8. Остеогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани (ММСК ЖТ) после инкубации с матриксами PLA/PRP-Ad-BMP2 на 14-е сутки: a — относительный уровень экспрессии генов маркёров остеогенной дифференцировки (Bglap, Spp1 и Alpl) и активность щелочной фосфатазы Alpl после 14 сут инкубации ММСК ЖТ с матриксами, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени; * p < 0,05 (по сравнению с PLA/PRP); b — очаги минерализованного внеклеточного матрикса в культурах ММСК ЖТ, окрашивание ализариновым красным, 10×. PLA — полимолочная кислота (polylactic acid), PRP — обогащённая тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma).

Fig. 8. Osteogenic differentiation of adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells (AD-MSCs) after incubation with PLA/PRP–Ad-BMP2 matrices for 14 days: a, relative expression levels of osteogenic differentiation marker genes (Bglap, Spp1, and Alpl) and alkaline phosphatase (Alpl) activity after 14 days of AD-MSC incubation with matrices, real-time polymerase chain reaction; * p < 0.05 compared with PLA/PRP; b, areas of mineralized extracellular matrix in AD-MSC cultures, Alizarin Red staining, ×10. PLA, polylactic acid; PRP, platelet-rich plasma.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате работы получены матриксы PLA/PRP-Ad-BMP2, которые могут являться перспективными остеопластическими материалами в генной терапии костной ткани для заживления дефектов.

Несмотря на то, что использование аденовирусных векторов вызывает опасения в связи с возможной реакцией со стороны иммунной системы, эффективность переноса генетического материала с помощью вирусных конструкций превышает во много раз эффективность невирусных методов доставки, что даёт возможность создавать ГАМ с меньшей концентрацией векторов для достижения терапевтического эффекта [33, 34]. Кроме того, ДНК аденовирусов не встраивается в геном клетки-хозяина, а находится в ядре в виде эписомы, что ограничивает по времени экспрессию гена остеогенных белков, тем самым позволяя снизить возможные нежелательные побочные эффекты, так как чрезмерный синтез остеогенных факторов может приводить к избыточному росту кости за пределами повреждения [35, 36].

Использование микрочастиц PLA и PRP позволило сформировать биосовместимые матриксы, которые импрегнировали аденовирусными конструкциями с геном BMP2. Микрочастицы из PLA играли роль депо для векторов, а гидрогель, полученный из PRP, обеспечивал удержание микрочастиц и пролонгированное высвобождение генетических конструкций за счёт формирования плотного сгустка. В ранее опубликованном исследовании показано, что выход векторов из матриксов на основе нановолокон PLGA (поли(D,L-лактид-со-гликолида) составлял 50% за первый час [37], а в полученных в данной работе ГАМ PLA/PRP-Ad-BMP2 способствовали постепенному высвобождению генетических конструкций в течении 15 сут, что может в дальнейшем (при имплантации матрикса в область костного дефекта) обеспечить пролонгированное высвобождение векторов на протяжении нескольких недель. Скорость выхода векторов является важным показателем, поскольку для достижения эффективной регенерации костной ткани синтез BMP2 в результате трансдукции должен начаться после окончания ранней стадии воспаления в месте имплантации, так как воздействие на протекание данной фазы может нарушить формирование кости и повысить риск осложнений [38, 39]. Кроме того, благодаря применению биоматериалов может осуществляться экранирование иммуногенных эпитопов аденовирусных векторов от клеток врождённого иммунитета, что помогает снизить продукцию провоспалительных цитокинов и повысить эффективность использования ГАМ [40].

Разработанные в настоящей работе ГАМ показали себя как биосовместимые материалы, в отличие от матриксов на основе PLGA, которые вызывали воспалительную реакцию in vivo [37]. Они не оказывали цитотоксического действия, а использование PRP способствовало повышению числа жизнеспособных клеток, что может быть вызвано стимуляцией пролиферации клеток ростовыми факторами [41]. В дополнение можно утверждать, что в отличие от матриксов на основе биоактивнго стекла [42] доказано наличие остеоиндуктивных свойств разработанных матриксов in vitro. PLA/PRP-Ad-BMP2 способствовали увеличению экспрессии маркёров остеогенной дифференцировки в ММСК ЖТ, а также минерализации внеклеточного матрикса.

Таким образом, можно сделать вывод, что ГАМ на основе микрочастиц PLA и PRP, импрегнированные Ad-BMP2, обладают биосовместимостью и показывают остеогенный потенциал в экспериментах in vitro, что позволяет предположить перспективы их применения в клинике после проведения исследований на моделях in vivo.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе были разработаны ГАМ на основе микрочастиц PLA и PRP, импрегнированных аденовирусными конструкциями с геном BMP2. Данные ГАМ являются биосовместимыми, что продемонстрировано в экспериментах in vitro и in vivo. Микрочастицы PLA с добавлением гидрогеля PRP способствуют пролонгированному высвобождению аденовирусных конструкций и постепенной трансдукции ММСК ЖТ. Кроме того, ГАМ имеют остеоиндуктивные свойства и стимулируют in vitro остеогенную дифференцировку ММСК ЖТ. Таким образом, полученные остеопластические материалы PLA/PRP-Ad-BMP2 являются перспективными для регенерации костной ткани за счёт целенаправленной доставки генов-остеоиндукторов и стимуляции остеогенеза.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. И.А. Недорубова, Т.Б. Бухарова — концептуализация; В.П. Басина, В.О. Черномырдина, А.Ю. Меглей, Ю.Д. Загоскин, А.В. Миронов — осуществление научно-исследовательского процесса, включая выполнение экспериментов и сбор данных; В.П. Басина, И.А. Недорубова — написание текста; Т.Б. Бухарова, Т.Е. Григорьев — редактирование статьи; О.В. Махнач, Д.В. Гольдштейн, Т.Б. Бухарова — административное управление планированием и проведением исследования. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Неприменимо.

Этическая экспертиза. Проведение исследования и использование лабораторных животных одобрено локальным этическим комитетом Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова (№ PRC-079 от 6 апреля 2021 г.).

Согласие на публикацию. Неприменимо.

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» в части биологических исследований и государственного задания Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» в части создания полилактидных микрочастиц и проведения сканирующей электронной микроскопии.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали один внешний рецензент, два члена редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: I.A. Nedorubova, T.B. Bukharova: conceptualization; V.P. Basina, V.O. Chernomyrdina, A.Yu. Meglei, Yu.D. Zagoskin, A.V. Mironov: investigation, data curation; V.P. Basina, I.A. Nedorubova: writing — original draft; T.B. Bukharova, T.E. Grigoriev: writing — review & editing; O.V. Makhnach, D.V. Goldshtein, T.B. Bukharova: project administration, investigation. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgments: Not applicable.

Ethics approval: The study and the use of laboratory animals were approved by the Local Ethics Committee of First Sechenov Moscow State Medical University (Minutes No. PRC-079, dated April 6, 2021).

Consent for publication: Not applicable.

Funding sources: The study was carried out as part of the state assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation for the Research Center for Medical Genetics (biological research) and the state assignment of the National Research Center Kurchatov Institute (production of polylactide microparticles and scanning electron microscopy).

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved one external reviewers, two members of the Editorial Board, and the in-house scientific editor.

¹ Здесь и далее: лекарственное средство не зарегистрировано в Российской Федерации.

About the authors

Viktoriia P. Basina

Research Centre for Medical Genetics

Author for correspondence.
Email: vika.basina12@gmail.com
ORCID iD: 0009-0006-0127-6502
SPIN-code: 7315-1862
Russian Federation, Moscow

Irina A. Nedorubova

Research Centre for Medical Genetics

Email: nedorubova.ia@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8472-7116
SPIN-code: 1548-6998

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

Victoria O. Chernomyrdina

Research Centre for Medical Genetics

Email: victoria-mok@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3828-8495
SPIN-code: 6988-4309
Russian Federation, Moscow

Anastasiia Yu. Meglei

Research Centre for Medical Genetics

Email: an.megley95@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2970-7176
SPIN-code: 5569-9070
Russian Federation, Moscow

Oleg V. Makhnach

Research Centre for Medical Genetics

Email: buben6@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2707-8313
SPIN-code: 1453-9189

Cand. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Moscow

Anton V. Mironov

National Research Centre "Kurchatov Institute"

Email: scftlab@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8173-0253
SPIN-code: 7185-9165

Cand. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Moscow

Timofei E. Grigoriev

National Research Centre "Kurchatov Institute"

Email: timgrigo@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8197-0188
SPIN-code: 6159-4220

Cand. Sci. (Physics and Mathematics)

Russian Federation, Moscow

Yuriy D. Zagoskin

National Research Centre "Kurchatov Institute"

Email: zagos@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-5825-8333
SPIN-code: 8293-5020

Cand. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Moscow

Dmitry V. Goldshtein

Research Centre for Medical Genetics

Email: dvgoldshtein@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2438-1605
SPIN-code: 7714-9099

Dr. Sci. (Biology), Professor

Russian Federation, Moscow

Tatiana B. Bukharova

Research Centre for Medical Genetics

Email: bukharova-rmt@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0481-256X
SPIN-code: 2092-5580

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files