Pro-Regenerative Effects of 5-Hydroxytryptamine in Cultured Dermal Fibroblasts and Subcutaneous Adipose Tissue–Derived Mesenchymal Stromal Cells

Full Text

Введение

Фибробласты кожи (ФД) и мезенхимальные стромальные клетки подкожно-жировой клетчатки (МСК-ПЖК) играют важную роль в регуляции регенерации эпителиальных покровов при повреждениях и, связанных со старением, морфологических дефектов и структурных дефицитов. Известно, что, например, ФД и МСК-ПЖК не только пролиферируют и дифференцируются в клетки кожи для восстановления поврежденных или мертвых клеток, но также действуют аутокринным и паракринным путем для активации регенерации клеток и процесса заживления. Во время заживления ран прогениторные и стволовые клетки подкожной жировой клетчатки (ПЖК) быстро вовлекаются в регенераторные процессы, мигрируют в участки повреждения, с одновременной их дифференциацией в дермальные фибробласты, эндотелиальные клетки и кератиноциты. Кроме того, ФД и МСК-ПЖК являются основными источниками белков внеклеточного матрикса (ВКМ), участвующих в поддержании структуры и функций кожи. Их взаимодействие с клетками кожи участвует в регуляции гомеостаза кожи и в процессе заживления. Данные исследований свидетельствуют о том, что ФД и МСК-ПЖК участвуют в регуляции воспаления, которое возникает в ответ на повреждение ткани. Они обеспечивают: изменение фенотипа макрофагов, вовлеченного в воспалительную фазу и образование новых кровеносных сосудов, тем самым способствуя ангиогенезу за счет увеличения дифференциации эндотелиальных клеток и миграции клеток. А также способствуют образованию грануляционной ткани, клеток кожи и продукции ВКМ, посредством чего происходят фазы пролиферации и ремоделирования [1]. Несмотря на многообещающую способность к дифференцировке, миграции и паракринные эффекты, для восстановления поврежденной ткани, трансплантация ФД и МСК-ПЖК остается сложной задачей из-за низкого приживления клеток, их низкой выживаемости и субоптимальных условий трансплантации. В последнее время использования различных типов прогениторных и стволовых клеток как самостоятельной терапии, заменяется подходом, при котором происходит активация собственных стволовых клеток организма с помощью внеклеточных факторов, таких как везикулы, цитокины и тд. До сих пор недостаточно изучена роль многих системных гуморальных регуляторов, таких как гормоны, цитокины межклеточного взаимодействия, и в частности биогенные амины, обладающие широким спектром биологической активности.

В частности, 5-Гидрокситриптамин (5-НТ, серотонин) — один из наиболее изученных нейротрансмиттеров центральной нервной системы (ЦНС), который выполняет множество физиологических функций вне ЦНС. К ним относятся - стимуляция выработки цитокинов и хемокинов, вазоконстрикция, регенерация тканей, клеток (фибробластов, гладкомышечных клеток, эндотелиальных клеток), пролиферация и миграция (эозинофилов, тучных клеток, дендритных клеток) и регуляция иммунной системы. Известно, что 5-НТ оказывает свое действие путем связывания с рецепторами клеточной поверхности, которые подразделяются на семь отдельных семейств (от 5-НТ₁ до 5-НТ₇), включающих 14 различных подтипов в зависимости от их структурного разнообразия и способа действия. Эффекты 5-НТ на воспалительные клетки в значительной степени опосредованы одним или несколькими из следующих рецепторов: 5-НТ_1А, 5-НТ_2А, 5-HT₃, 5-HT₄ и 5-HT₇ [2].

В одних из последних исследований стала известна роль 5-НТ как важного метаболического гормона, способствующего гомеостазу глюкозы и ожирению, при этом существует причинно-следственная связь между уровнями циркулирующего 5-НТ и метаболическими заболеваниями [3].

Так же в исследованиях было обнаружено, что серотонин, полученный из тромбоцитов, опосредует регенерацию печени после обширной гепатэктомии и повышает выживаемость животных на мышиной модели частичного ОТП. Эти наблюдения были связаны с индукцией экспрессии рецептора Htr2 после гепатэктомии [4, 5]. Обнаруженные эффекты серотонина на усиление пролиферации ткани печени позволяют рассматривать его как кофактор стимуляции в лечение состояний, характеризующихся сниженным регенераторным потенциалом и приводящих к нарушению заживления тканей. Однако, в литературе имеется очень незначительное количество информации по регенераторным и пролиферативным эффектам серотонина на другие ткани и клетки, в частности влияние серотонина на регенерацию кожного покрова вызвало у нас дополнительный интерес и способствовало дальнейшим исследованиям в данном направление.

Учитывая вышесказанное, целью нашей работы было изучение влияния серотонина на регенераторный потенциал (пролиферацию, миграцию, клеточную гибель) фибробластов дермы и мезенхимальных стромальных клеток подкожной жировой клетчатки в эксперименте in vitro.

Материалы и методы.

Исследование проводилось на первичных культурах фибробластов кожи и мезенхимальных стромальных клеток подкожной клетчатки, получаемых от крыс линии Wistar. Забор биологического материала проводился в соответствии с правилами и этическими нормами ГОСТ Р53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Первичные культуры фибробластов дермы (ФД) и мезенхимальных стромальных клеток подкожной жировой клетчатки (МСК-ПЖК) получали стандартными отработанными методами, по протоколам – «Выделение, культивирование и криоконсервация первичной культуры дермальных фибробластов человека» и «Выделение, культивирование и криоконсервация первичной культуры мезенхимных клеток из подкожной жировой клетчатки человека», соответственно [6].

Жизнеспособность клеточных культур поддерживалась в условиях СО₂ инкубатора (Binder CB150), путем периодической смены питательной среды (каждые 3 суток, готовая среда в соответствии с серией эксперимента), в чистых условиях ламинарного бокса микробиологической безопасности (БМБ-II-«Ламинар-С»-1,8).

Полученные, в ходе культивирования ФД и МСК-ПЖК по достижению необходимой массы были поделены на 2 серии (всего 4 серий). Пассаж производился в 3,5 сантиметровые чашки Петри по 10 тыс. клеток на чашку. Через 24 часа от пассажа, стандартные питательные среды были заменены на соответствующие сериям эксперимента: ФД в стандартной питательной среде, МСК-ПЖК в стандартной питательной среде, ФД с добавлением в среду серотонина адипината, МСК-ПЖК с добавлением в среду серотонина адипината. Введение в среду серотонина адипината (10 мг/мл, ООО “ЛОРР+К”, Россия) производилось из расчета 6,6 мкг на 1 мл питательной среды.

Статистическая обработка результатов исследований осуществлялась в программе MS Excel, сравнение гипотез проводилось по U-критерию Манна-Уитни и по Т-критерию Уэлча, используя онлайн-калькулятор (https://www.statskingdom.com/170median_mann_whitney.html; https://www.statskingdom.com/150MeanT2uneq.html). Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Оценка пролиферации производилась путем ежедневного подсчета клеток в течение пяти дней, в тридцати полях зрения в каждой чашке с помощью микроскопа Axio Vert.A1.

Оценка миграции ФД и МСК-ПЖК осуществлялась методом «культуральной раны» в стандартных условиях и в условиях добавления серотонина, при помощи пакета программ анализа изображений ZEN (Carl-Zeiss). Следующая за нанесением «царапины» визуализация, при помощи микроскопа Axio Vert.A1, осуществлялась через 24 и 48 часов, для оценки уменьшения искусственно нанесенного дефекта. Анализ и расчёт средних величин проводился по более чем десяти полям «культуральной раны», в каждой серии культур клеток, двумя способами. Первым способом измерялось уменьшение «дефекта», в микрометрах, от линий краёв раны на сближение. Во втором способе проводился подсчет количества клеток, оказавшихся (мигрировавших) за линиями краёв «царапины» с обеих сторон.

Количественный анализ клеточной гибели в результате апоптоза и/или некроза производился флуоресцентной микроскопией (система визуализации EVOS M7000) методом двойного окрашивания аннексином и йодистым пропидием набором ANNEXIN V-FITC/PI (ServiceBio) в тесте «живые и мертвые», путем подсчета в чашках в тридцати рандомных полях зрения клеток с разными «метками»: апоптотических (Аннексин⁺PI^-); некротических (Аннексин⁺PI⁺).

 

Результаты исследования:

 

Изучение морфологии клеток в фазовом контрасте.

В морфологической картине полученных культур ФД и МСК-ПЖК в стандартной питательной среде по сравнению с клетками контрольных серий с добавлением серотонина отличий не наблюдалось. В культурах отмечался большой процент звездчатых, полигональных, распластанных форм клеток, соответствующих морфологической картине фибробластоподобных клеток и МСК-ПЖК, соответственно, с различимыми ядрами, ядрышками (от 2 до 3), неравномерной плотностью цитоплазмы и перинуклеарной зернистостью, наблюдаемой при наличии секреторной активности.

ФД по приросту клеток в культурах клеток с добавлением серотонина отличались от таковых, содержащихся на стандартной питательной среде (рис.1). Процент клеток в среде с серотонином оказался выше на 22% в первый (P=0,0003), на 45% во второй (P=0,00004), на 25% в третий (P=0,0003), на 35% в четвертый(P=0,00003) и на 13% в пятый день (P=0,005) эксперимента.

МСК-ПЖК, также отреагировали на введение в стандартную среду серотонина повышением пролиферации (p<0,001). Так процент клеток в среде с серотонином оказался выше на 5,4% в первый (P=0,3), на 12,6% во второй (P=0,00002), на 6,8% в третий (P=0,49), на 25% в четвертый(p=0,0004) и на 25,5% в пятые дни (P=0,03) эксперимента.

Время удвоения ФД в контроле составило 31 час, в культурах клеток с добавлением в среду серотонина адипината - 27 часов. В культурах МСК-ПЖК в контроле время удвоения составило 38,2 часа, а в сериях с добавлением серотонина - 35,7 часов.

Оценка миграции методом «царапины» показала, что среднее расстояние, преодолеваемое ФД, инкубируемыми в условиях стандартной питательной среды, за 24 часов, составило 244,2 ±13 мкм (рис.2). У МСК-ПЖК, на стандартной среде, тот же показатель, составил 133,1 ±23 мкм.

У культур ФД инкубация в условиях добавления серотонина чуть превышала цифры стандартной среды, а у культур МСК-ПЖК привела к заметному повышению условной скорости миграции клеток. Так за исследуемый период времени среднее расстояние миграции клеток кожи в условиях добавления серотонина составило 248,9 мкм ±18,9 мкм, клеток ПЖК – 209,6 мкм.

Подсчет количества мигрировавших клеток показал результаты (рис.3), указывающие на повышение условной скорости перемещения, как ФД, так и МСК-ПЖК в условиях добавления серотонина.

 

При оценке путей гибели клеток в результате апоптоза и/или некроза, производившейся путем двойного окрашивания аннексином и пропидия йодидом (рис.4), в серии исследования клеток дермального происхождения, культивируемых на стандартной питательной среде в тридцати полях зрения Аннексин⁺PI^- (апоптотических) отмечалось в среднем от 3 до 4 клеток, а Аннексин⁺PI⁺ (некротических) от 22 до 24 клеток. А в клетках, с добавлением серотонина в питательную среду, при подсчете в тридцати полях зрения, Аннексин⁺PI^-, то есть с признаками апоптоза, отмечалось в среднем от 1 до 2 клеток, а Аннексин⁺PI⁺ (некротических) от 17 до 20 клеток.

 

Обсуждение результатов:

Учитывая тенденции развития клеточных технологий, в последние годы, наблюдается переход от искусственных биоматериалов к модуляции регенеративных процессов, активирующих ресурсы самого организма и ускоряющих естественные механизмы заживления. Серотонин, наряду с иммунными клетками и тромбоцитами, участвует в общем процессе заживления ран, обладая способностью активации пролиферации, повышению выживаемости и миграции клеток [7]. Более того, многочисленные данные свидетельствуют о том, что введение аутологичных тромбоцитов улучшает заживление кожных ран [8], при этом они являются резервуарами серотонина, который, возможно, и запускает механизм адгезии и миграции клеток. Учитывая выше сказанное, идея данной работы была основана на гипотезе о том, что сигнализация серотонина может усиливать регенераторный потенциал стволовых клеток тканевой ниши кожи и подкожной жировой клетчатки и, соответственно, способствовать заживлению ран. Так, по результатам наших in vitro исследований, культуры клеток, с добавлением в питательную среду серотонина отличались от контрольной группы лучшей выживаемостью и сокращением времени удвоения клеток. Полученные данные подтверждаются рядом исследований, так в работе Sadiq A и соавт. было показано влияние серотониновой сигнализации на жизнеспособность клеток человеческих фибробластов и неонатальных кератиноцитов, где исследователи отмечали повышение выживаемости фибробластов и кератиноцитов человека, что дополнительно подтвердилось снижением жизнеспособности при прерывании серотониновой сигнализации путем добавления кетансерина (ингибитора 5HTR2a) и флуоксетина. При этом, анализ путей клеточной гибели, в исследовании авторов, показал, что серотонин обладает выраженным антиапоптотическим действием на культурах фибробластов, что также соответствует полученным нами результатам на ФД и МСК-ПЖК, и может объяснять один из путей (или механизмов) прироста клеток под действием серотонина, наблюдаемый в нашем исследовании.

Попытка объяснения механизмов регенераторных эффектов серотонина была предпринята в серии исследований Naito, K и соавт. [9] и Kimura M и соавт. [10], где было обнаружено, что 5-HT стимулирует аутокринную секрецию TGF-α из гепатоцитов через путь 5-HT_2B/Gq/фосфоинозитид-специфической фосфолипазы C (PLC)/Ca²⁺, а секретируемый TGF-α напрямую стимулирует синтез ДНК и пролиферацию гепатоцитов (рис.5).

Также, механизм, как пролиферативного эффекта серотонина, так и активации миграции, был наиболее детально изучен на клетках гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) [11]. Активация рецептора 5-HTR_1D подтипа запускает реакции активации Tcf/Lef, в результате которых происходит накопление β-катенина, что приводит к запуску пролиферации и дифференцировки клеток. Также активация рецептора 5-HTR_1D подтипа также может активировать FOXO6 через путь PI3K/AKT, что наряду с активацией пути AKT/FOXO3α через 5-HTR_2B, способствовало пролиферации, образованию колоний, миграции клеток ГЦК. Сигнализация через 5-HTR_1D также увеличивает экспрессию белков, связанных с путем Wnt/β-катенина, и целевых генов, ассоциированных с избыточной пролиферацией у опухолевых клеток, включая β-катенин, сурвивин, C-myc и циклин D1. Эти пути также активируют комплекс mTOR и, таким образом, приводят к ингибированию процесса аутофагии, что также является дополнительным фактором, обуславливающим позитивное влияния серотонина на пролиферацию.

В иммунной системе адгезия и миграция клеток необходимы для различных функций, таких как экстравазация, хемотаксис, фагоцитоз, презентация антигена, секреция мигрирующих цитокинов и внеклеточных матриксов, при этом, активация 5-HTR может прямо или косвенно участвовать в этих механизмах. Известно, что 5-HT действует как хемоаттрактант для эозинофилов [12] и вызывает in vitro зависимую от 5-HT 2A миграцию человеческих эозинофилов, а также in vivo перемещение и миграцию эозинофилов, полученных из костного мозга мышей, в воспаленных посткапиллярных венулах [13]. В нашем исследовании, повышение условной скорости миграции в культурах с добавлением в питательную среду серотонина проявилось и в стволовых клетках ниш дермального происхождения и ПЖК, при этом большая условная скорость перемещения была отмечена у клеток, полученных из ПЖК, по сравнению с клетками дермального происхождения. В работе Jayakumar и соавт. было показано, что активация серотонином 5-HTR, играла значительную роль в адгезии, ремоделировании цитоскелета, миграции и пролиферации гладкомышечных клеток сосудов, тучных клеток, эозинофилов, дендритных клеток. Активирующие миграцию эффекты 5-HT на гладкомышечные клетки были экспериментально продемонстрированы на культивируемых гладкомышечных клетках аорты крысы [14] и гладкомышечных клетках легочной артерии быка [15], и было обнаружено, что в этом участвуют рецепторы 5-HT₂ и 5-HT₄ соответственно. Важно отметить, что исследования in vitro, в частности анализ методом культуральной царапины, зависит не только от уровня миграции клеток, но и от пролиферативного состояния клеток, что требует дополнительного изучения.

Выводы

Активация сигнальных механизмов серотонина играет важную роль в заживлении ран в контексте различных травм кожи и подкожно жировой клетчатки, способствуя повышению клеточной жизнеспособности, пролиферации и миграции ФД, и МСК-ПЖК, что было продемонстрировано в нашем исследовании. Следовательно, можно предположить, что агонисты серотонина или 5HTR могут быть потенциальными кандидатом для улучшения заживления кожи у пациентов с травмами. При этом сигнальное влияние серотонина на клетки имеет выраженную гистотопическую избирательность и варьирует в зависимости от рецепторов и внутриклеточных сигнальных путей активации вторичных посредников. Пролиферативные эффекты и активация миграции, как в опухолевых клетках, так и фибробластах опосредуются индукцией, через рецепторы 5-HTR_1D и 5-HTR_2B классов, ключевых посредников внутриклеточной сигнализации PI3K/AKT, а также пути Wnt/β-катенин, что наряду с mTOR зависимым ингибированием аутофагии способствует, как позитивному регенераторному влиянию, так и опухолевой прогрессии. Более детальное выяснение механизмов позволит селективно стимулировать регенерацию ран кожи, не оказывая проонкогенные эффекты. Также, необходимы дальнейшие эксперименты для изучения роли серотонина и его рецепторно-опосредованных эффектов, чтобы улучшить наше понимание роли серотонинергической системы в заживлении ран.

About the authors

Tamara T. Chibirova

Institute of Biomedical Investigations — the affiliate of Vladikavkaz Scientific Centre of RAS

Author for correspondence.
Email: tamaramerdenova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0819-8915
SPIN-code: 2736-0620
Russian Federation, Vladikavkaz

Romesh I. Kokaev

Institute of Biomedical Investigations — the affiliate of Vladikavkaz Scientific Centre of RAS

Email: romesh_k@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2326-1348
SPIN-code: 5918-9041
Scopus Author ID: 57864492300

MD, Cand. Sci. (Med.), Associate Professor

Russian Federation, Vladikavkaz

Altynbek A. Islaev

Institute of Biomedical Investigations — the affiliate of Vladikavkaz Scientific Centre of RAS

Email: romesh_k@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7800-8593
SPIN-code: 6435-1072
Russian Federation, Vladikavkaz

Gavril S. Kokaev

Email: zigavrik@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-8910-3537
SPIN-code: 3329-3030

S. V. Skupnevskii

Institute of Biomedical Research, Russian Academy of Sciences; North-Ossetian State University; North-Ossetian State Medical Academy

Email: dreammas@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6233-5944
SPIN-code: 7922-4399
Vladikavkaz, Russia

References

Supplementary files