Optimization of Slow Freeze Protocol for 3D Cell Structures Using Brain Organoids and Chondrospheres as Models

Full Text

Введение

Органоиды представляют собой трёхмерные многоклеточные структуры, являющиеся дифференцированными производными стволовых клеток или клеток-предшественников органов. Органоиды, как правило, состоят из клеток различного типа, что обеспечивает поддержание его морфологии и функций. Строение и структура органоидов схожа с органами, что позволяет использовать органоиды для моделирования заболеваний, а также для регенеративной медицины и тестирования различных терапевтических средств [1, 2]. При масштабировании получения органоидов остро встает проблема их длительного хранения без значительной потери жизнеспособности и функциональной активности. Криоконсервация является одним из наиболее приемлемых способов сохранения биоматериала длительное время, с минимальными некритическими изменениями после разморозки. Такой подход достаточно беспроблемно применяется для консервации простых структур и культур клеток, но для более крупных объектов возникает ряд проблем, связанных неравномерной скоростью заморозки и повреждением внутренних структур кристаллами льда [3]. На данный момент описанных методов заморозки органоидов немного. К тому же, существует вероятность, что для каждого типа органоидов требуется изменение протокола криоконсервации. При этом, зарубежные коммерческие реагенты, как правило, не раскрывают состава криоконсерванта, что усложняет процесс заморозки в условиях импортозамещения. Таким образом, возникает потребность создания и оптимизации доступного способа криоконсервации органоидов, обеспечивающего сохранение функциональности, экспрессии основных маркеров и морфологии органоидов. Оптимизация условий криоконсервации органоидов позволит обеспечить длительное хранение органоидов и существенно упростит их использование в исследовательских или клинических целях.

Основными факторами, способствующими разрушению клетки при замораживании и разморозке, является формирование кристаллов льда из внутриклеточной и внеклеточной воды, которые разрывают клеточную мембрану, а также повышение концентрации солей в незамёрзшей фракции. Общий принцип замораживания клеточных культур, тканей и органоидов состоит в добавлении криопротектора в среду для заморозки, который, проникая в клетку, связывает внутриклеточную воду и не позволяет ей кристаллизоваться, поддерживая постоянную концентрацию солей. Криопротектором, как правило, служит диметилсульфоксид (ДМСО, Me2SO), этиленгликоль или пропандиол, а также, в некоторых случаях, сахароза. Каждый из этих криопротекторов обладает определенной цитотоксичностью, поэтому важно подбирать правильные концентрации для различных типов клеток и протоколов заморозки [4, 5].

Глобально все методы криоконсервации подразделяются на 2 способа: медленная заморозка и витрификация. Оба метода имеют ряд своих преимуществ и недостатков. Медленная заморозка отличается относительно небольшой концентрацией криопротектора (как правило, 7-10% от объёма), медленным охлаждением (со скоростью от −0.3 до −1°C/мин) и довольно быстрой разморозкой до температуры 36-37°C (в среднем за 3-5 минут). Медленная заморозка на данный момент является преобладающим методом криоконсервации ввиду простоты и удобства методологии, однако он имеет и свои недостатки. Основными факторами риска являются осмотический шок клеток при разморозке, что происходит если разморозка и замещение криосреды на среду без криопротектора происходит слишком быстро. При длительной отмывке от криопротектора проявляется и его цитотоксический эффект [6]. Полезной модификацией этого метода является добавление в криосреду ингибитора Rho-киназы Y-27632, повышающего выживаемость и жизнеспособность клеток и органоидов после размораживания [7, 8]. Для метода витрификации характерно присутствие больших концентраций криопротекторов (15-30%), а также высокая скорость охлаждения и разморозки, фактически, эти процессы происходят в течение нескольких секунд. В случае витрификации высококонцентрированный криопротектор при охлаждении достигает той температуры, при которой приобретает структуру и свойства стекла и не кристаллизуется, что позволяет замораживаемой клетке избежать осмотического шока и повреждений мембраны. Данный метод является более безопасным для замораживаемых объектов и широко используется для заморозки эмбрионов. К недостаткам этого метода можно отнести его большую трудоёмкость по сравнению с медленной заморозкой. Например, необходимо переносить замораживаемые объекты в несколько разных буферов, постепенно повышая концентрацию криопротекторов, а после помещения в финальную криосреду заморозка должна производиться незамедлительно. Кроме того, требуются дополнительные инструменты, такие как петли, програмные замораживатели и специализированные криохранилища с жидким азотом [9].

Хотя существует множество отработанных протоколов для криоконсервации суспензии клеток и эмбрионов, данных по криоконсервации органоидов на данный момент немного. Известно об использовании протокола медленной заморозки для криоконсервации органоидов из глиобластомы c использованием питательный среды с 10% ДМСО в качестве криопротектанта [10]. Однако стоит заметить, что опухолевые клетки обладают большей выживаемостью, чем здоровые, поэтому использование данного метода для криоконсервации дифференцированных нетрансформированных клеток остаётся под вопросом. Также известно о применении протокола медленной заморозки в безбелковой среде с 10% ДМСО к агрегатам нейрональных предшественников, дифференцированных из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) [11]. Недавние исследования показали возможность медленной криоконсервации нейросфер, полученных из кишечной нервной системы, а также нейрональных органоидов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в различных средах с10% ДМСО [12, 13]. Тем не менее, данных для органоидов из нейрональных производных ИПСК в настоящее время недостаточно.  К тому же, неизвестно, повлияет ли уменьшение концентрации ДМСО на выживаемость органоидов после криоконсервации. Также не было получено данных об оптимальной стадии дифференцировки нейрональных органоидов для криоконсервации. Что касается производных других тканей, показано успешное применение протокола медленной заморозки для кишечных и печёночных органоидов, полученных их эпителиальных стволовых клеток и кишечной ткани, соответственно, а также органоидов сетчатки, полученных из ИПСК [14, 15]. Также известны работы о медленной заморозке и хрящевых биоптатов нативной ткани [16]. Данных о криоконсервации органоидов сердца на текущий момент немного [17–19]. Ряд исследований показывает, что витрификация является более предпочтительным методом криоконсервации по сравнению с медленной заморозкой [6, 9, 20]. Тем не менее, такие данные были получены не для дифференцированных производных ИПСК, а для сфероидов МСК, островков Лангерганса и органоидов рака лёгких [9, 20, 21], имеющих более рыхлую структуру.

Особенно важной биомедицинской задачей является разработка и оптимизация протоколов криоконсервации нейрональных органоидов и хондросфер. Решение этой задачи поможет облегчить накопление биоматериала для фундаментальных исследований и медицинской практики. Криоконсервация органоидов позволит улучшить и стандартизировать моделирования заболеваний мозга и хрящевой ткани, а также использовать их для скрининга новых терапевтических препаратов против заболеваний, которые на данный момент являются наиболее распространёнными в популяции. Более того, оптимизация криоконсервации мозговых и хондросфер позволит стандартизировать процесс доклинических исследований лекарственных препаратов in vitro. Таким образом, вопрос выбора оптимального метода заморозки органоидов по-прежнему остаётся не до конца изученным, а оптимизация методов криоконсервации облегчит дальнейшие биомедицинские исследования.

Цель

Цель данного исследования заключалась в оптимизации протокола криоконсервации для нейрональных органоидов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Была поставлена задача подобрать среду для криоконсервации с наименьшим влиянием на морфофункциональные характеристики органоидов, а также определить стадию дифференцировки нейрональных органоидов, наиболее оптимальную для заморозки. На основе полученных данных была выбрана наилучшая криосреда, которую тестировали и для заморозки хондросфер из культур хондроцитов различного генеза с последующей оценкой целостности и морфофункционального состояния после цикла замораживания-оттаивания.

Материалы и Методы

Дизайн эксперимента представлен на рисунке 1.

Дифференцировка нейрональных производных ИПСК и получение органоидов заднего мозга

Для дифференцировки в нейрональные производные использовали линию ИПСК IPSFD5S с женским кариотипом, полученную из фибробластов здорового донора и охарактеризованную ранее [22]. ИПСК сеяли на предварительно обработанную раствором матригеля (Corning, США) чашку Петри диаметром 35мм и вели в среде mTesR1 (StemCell Technologies, Канада) + ГибриС8 (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:4. Для получения органоидов среднего мозга использовали ранее опубликованный протокол с модификациями [23]. После достижения ИПСК 90% конфлюэнтности снимали клетки 0,05% раствором трипсина (ПанЭко, Россия) и сворачивали их в сфероиды при помощи планшетов AggreWell™800 (StemCell Technologies, Канада) в соответствии с протоколом производителя. Через сутки сфероиды переносили в биореакторы в среду №1 следующего состава: Advanced DMEM/F12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 10 ng/mL bFGF (Miltenyi Biotec, Германия), 2% НейроМакс (ПанЭко, Россия), 1% N-2 (ПанЭко, Россия), 10 μM SB431542 (StemCell Technologies, Канада), 1% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific, США), 3 μM Dorsomorphin (Miltenyi biotec, Германия), 0.1 μM LDN193189 (Miltenyi biotec, Германия), 1% Пенициллин/Стрептомицин (ПанЭко, Россия). Сфероиды культивировались в течение 7 дней в биореакторе на орбитальном шейкере при 70 об/мин, температуре 37℃ и содержании CO₂ 5%. Среду меняли раз в 2 дня. На 7 день сфероиды переводили в среду №2 (Advanced DMEM/F12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 10 ng/mL bFGF (Miltenyi Biotec, Германия), 2% НейроМакс (ПанЭко, Россия), 1% N-2 (ПанЭко, Россия), 1% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific, США), 3 μM Purmorphamine (Miltenyi biotec, Германия), 1% Пенициллин/Стрептомицин (ПанЭко, Россия)) и культивировали 7 дней в минибиореакторе на орбитальном шейкере при 70 об/мин, температуре 37℃ и содержании CO₂ 5%. Среду меняли раз в два дня. На день 14 органоиды переводили в среду №3 следующего состава: Advanced DMEM/F12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 10 ng/mL bFGF (Miltenyi Biotec, Германия), 2% НейроМакс (ПанЭко, Россия), 1% N-2 (ПанЭко, Россия), 1% KnockOut Serum Replacement (Thermo Fisher Scientific, США), 20 ng/mL BDNF (Miltenyi Biotec, Германия), 20 ng/mL GDNF (Miltenyi Biotec, Германия), 1% Пенициллин/Стрептомицин (ПанЭко, Россия). Далее культивировали в минибиореакторе на орбитальном шейкере при 70 об/мин, температуре 37℃ и содержании CO₂ 5%. Среду меняли раз в два-три дня.

Получение хондросфер

Хондроциты выделяли из биопсийного (операционного) препарата пациентов, как описано ранее [24]. После достижения хондроцитами 70% конфлюэнтности клетки снимали с шестилуночных планшетов с помощью 0,05% раствора трипсина (ПанЭко, Россия). После кратковременной промывки в среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% FBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) клетки центрифугировали 5 минут при скорости 200 g. Затем клетки переносили в 96-луночные планшеты, покрытые 1,5% агарозой, с плотностью 100 000 клеток на лунку. Клетки культивировали в 150 мкл полной среды для хондроцитов (DMEM/F12 (ПанЭко, Россия), 2 mM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, США), 1% пенициллина/стрептомицина (ПанЭко, Россия) и 10% FBS (HiMedia, Индия)) в течение 1-3 дней. Затем сфероиды извлекали из лунок с помощью пипетки Пастера объёмом 3 мл и переносили в 15мл пробирку. Впоследствии супернатант собирали после того, как сфероиды отстоялись в течение 2-3 минут. Затем сфероиды погружали в свежеоттаявший неразбавленный раствор Матригеля (Corning, США), поддерживаемый при температуре +4°С. Через 30 минут сфероиды удаляли либо путем пассивного осаждения в пробирке емкостью 15 мл, либо путем центрифугирования в течение одной минуты при 100 g. Далее сфероиды переносили в минибиореакторы [25] и помещали на орбитальный шейкер (Infors, Швейцария) в CO₂-инкубатор (температура 37°C, 5% CO₂, 70 об/мин). Среду заменяли еженедельно или по мере истощения среды без использования центрифугирования. Сфероидам давали осесть под действием силы тяжести в пробирке емкостью 15 мл, после чего супернатант удаляли, в пробирку добавляли эквивалентный объем свежей среды и органоиды возвращали в минибиореакторы.

Заморозка органоидов

Органоиды заднего мозга замораживали на 9, 14, 22, 29 и 43 день после сворачивания в сфероиды и начала дифференцировки. Для этого предварительно готовили среды для криоконсервации (табл. 1).

На каждой временной точке пипеткой Пастера объёмом 3,5 мл аккуратно отбирали 10-15 органоидов и переносили их в 1,5 мл пробирку. После осаждения органоидов через 2-3 минуты, удаляли остатки среды для культивирования и добавляли 500 мкл криосреды, после чего переносили органоиды в криовиалу. Виалу оставляли на 30 минут при температуре +4°C, а затем помещали на -80°C. Через сутки виалу переносили в жидкий азот.

Хондросферы замораживали в среде 82% DMEM+10% FBS+8% DMSO+ROCK inhibitor на 29 день культивации с момента сворачивания, так же, как и нейросферы.

Разморозка и культивирование органоидов

Для разморозки органоидов в качестве среды для отмывки от криопротектора использовали DMEM/F12 с 1% пеницилина-стремомицина (ПанЭко, Россия). Криовиалу после извлечения из жидкого азота нагревали в течение 2 минут при 37°C. Затем пипеткой Пастера отбирали содержимое виалы и переносили в 4 мл отмывочной среды и плавно перемешивали. После осаждения органоидов под действием силы тяжести практически полностью отбирали надосадочную жидкость и ресуспендировали в среде для соответствующего типа клеток и стадии дифференцировки. Затем органоиды переносили в минибиореакторы и оставляли в инкубаторе на орбитальном шейкере при 70 об/мин. Среду меняли 1 раз в 3-4 дня.

Оценка целостности и размеров органоидов

В день разморозки, на следующий день после разморозки, через неделю и через 2 недели органоиды фотографировали с помощью микроскопа Olimpus IX53 с камерой (U-LS30-3) и анализировали с помощью программного обеспечения с помощью программного обеспечения ImageJ [26]. Целостность органоидов и присутствие дебриса оценивали визуально.

Проведение qPCR

По истечении срока культивации после разморозки органоиды лизировали с помощью буфера ExtractRNA (Евроген, Россия) и выделяли РНК в соответствии с протоколом производителя. Оценка качества выделенной РНК проводилась при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле. Измерение концентрации РНК выполняли с помощью набора Equalbit BR RNA (Vazyme, Китай) и флуориметра Qubit (Invitrogen, США). РНК обрабатывали ДНКазой I (NEB, Великобритания) в соответствии с протоколом производителя. Для синтеза кДНК с матрицы РНК использовали MMLV RT kit (Евроген, Россия). Синтез проводили в соответствии с протоколом производителя. Для проведения ПЦР в реальном времени на одну лунку 96-луночного планшета (SSIbio, Scientific Specialities; США) добавляли 5 мкл 5х qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия), 1 мкл 10 мкМ праймера (таблица 2) 18,2 мкл воды и 1 мкл кДНК матрицы. В контрольные лунки планшета вместо кДНК матрицы добавляли еще 1 мкл воды. Реакцию проводили при использовании термоциклера для амплификации нуклеиновых кислот 1000 CFX Manager исполнения C10000 Touch (Bio-Rad, США) и программного обеспечения CFX Manager. Количество циклов — 39. Анализ результатов проводили в программе MS EXCEL-2108 (Microsoft, США) по методу ΔΔCt.

Иммуногистохимия (ИГХ)

Органоиды фиксировали в 4% растворе PFA в течение 10 минут, затем переводили в 10% раствор сахарозы на 1 час, затем в 30% раствор сахарозы на 24 часа. После этого органоиды отмывали в PBS и погружали в Tissue-Tek O.C.T.-Compound (Sakura Finetek, США) и охлаждали до -20°C для дальнейшей нарезки на криотоме (Thermo Fisher Scientific, США). Фиксированные органоиды нарезали слоями по 10 мкм и помещали на обработанные полилизином предметные стёкла. В качестве нейрональных маркеров для окрашивания использовали SOX2 (Rabbit anti-human SOX2, 1:100, ABclonal, США), MAP2 (Mouse anti-human MAP2, 1:200, ELK Biotechnology, США) и β-tubulin III (Rabbit anti-human TUBb3, 1:250, Affinity Biosciences, США). PCNA (proliferating cell nuclear antigen) был выбран в качестве маркера пролиферации (Mouse anti-human PCNA, 1:50, ELK Biotechnology, США). Для окрашивания хондроцитарных маркеров использовали первичные антитела на коллаген II типа (1:100, ab34712, Abcam, Великобритания), SOX9 (1:400, ES3481, ELK, США) и аггрекан (1:500, AHP0022, Invitrogen, США). В качестве вторичных антител применяли Goat Anti-Rabbit IgG Fc (Alexa Fluor® 488) (1:800, ab150089, Abcam, Великобритания) и Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555 (1:500, A-21422, Invitrogen, США). Для визуализации клеточных ядер использовался Dapi (D9542-5MG, Sigma-Aldrich, США).

Статистический анализ

Для оценки значимости изменения размеров и разницы выживаемости использовался сначала критерий Фишера, а затем непарный тест Стьюдента. В качестве ПО для подсчёта статистики использовался MS EXCEL-2108 (Microsoft, США). Для построения графиков использовалась RStudio-2023.12.1 (R Core Team, Австрия).

Результаты

Оценка выживаемости нейрональных органоидов через 2 недели после разморозки.

В ходе предварительного эксперимента ИПСК, полученные из фибробластов здорового донора, сворачивали в сфероиды и проводили дифференцировку в нейрональном направлении. Начиная с 3 дня дифференцировки раз в 3-5 дней отбирали органоиды для медленной криоконсервации. В качестве сред для заморозки использовали среды на основе FBS с содержанием ДМСО 10 и 8%, а также среду на основе DMEM с содержанием ДМСО 10% (табл. 1). После разморозки органоиды культивировали в течение 10 дней и оценивали количество неповреждённых органоидов.

Как видно из рисунка 2 A-B, в целом, не было значимой разницы выживаемости в зависимости от криосреды. Тем не менее, органоиды, замороженные в среде FBS+10%DMSO, показали наименьшую выживаемость на 10-ый день культивирования, поскольку наблюдались точки с выживаемостью меньше 40%. В то же время, уменьшение концентрации DMSO в криосреде на основе FBS способствовало большей выживаемости органоидов после разморозки: в среднем 60%, но не меньше 40%. В случае среды DMEM+10%FBS+10%ДМСО в трёх из семи временных точек дифференцировки не наблюдалось потери целостности органоидов после 10-дневного культивирования. Видно, что первая неделя после разморозки является наиболее важной для выживания органоидов после криоконсервации. Что касается оптимального срока дифференцировки для медленной заморозки органоидов, при последующей разморозке органоидов от 20, 22 и 27 дня дифференцировки наблюдалась наибольшая выживаемость, которая составила более 85%. По результатам предварительного эксперимента было принято решение исключить из эксперимента среду FBS+10%DMSO, а для среды DMEM+10%FBS+10%DMSO уменьшить концентрацию DMSO c 10 до 8%.

При повторном проведении эксперимента использовали 2 среды для криоконсервации: DMEM+10%FBS+8%DMSO и FBS+8%DMSO. В дальнейших экспериментах среды для краткости назвали DMEM и FBS соответственно. В данном эксперименте для зрелых нейрональных органоидов, «возрастом» более 3-х недель после старта дифференцировки, были получены схожие результаты. Выживаемость более зрелых органоидов оказалась выше, чем у незрелых (рис. 2C-D). При этом, для криосреды на основе DMEM на следующий день после разморозки для молодых органоидов наблюдалась фрагментация и формирование новых сфер, что увеличило количество целостных органоидов по сравнению с начальным числом. Также на рисунке 2D видно, что для зрелых органоидов среда на основе DMEM способствовала лучшей выживаемости, хотя статистически это подтвердить не удалось (p = 0.06, непарный тест Стьюдента).

В целом, полученные данные показывают, что состав сред не оказывает существенного влияния на выживаемость органоидов, и основную роль здесь играет стадия дифференцировки. Тем не менее, наблюдается тенденция, что уменьшение концентрации DMSO и использования в качестве основной составляющей криосреды DMEM положительно влияет на выживаемость органоидов.

Изменение диаметра нейрональных органоидов в течение 2 недель после разморозки

В течение всего периода культивирования органоидов, а также в течение 2-х недель после разморозки органоиды фотографировались для измерения диаметра и визуальной оценки морфологии (рис. 3). В день разморозки форма и размер органоидов, независимо от криосреды, не отличались от такового у интактных органоидов в соответствующий день дифференцировки. Однако на следующий день наблюдалось значительное количество клеточного дебриса. Его источником, вероятнее всего, служил наружный слой клеток органоидов, который, как видно из фотографии (рис. 3В), становился неровным. Этот эффект присутствовал на всех стадиях дифференцировки нейрональных органоидов и независимо от криосреды. Через неделю (рис. 3С) поверхность органоидов выравнивалась, становясь гладкой. Однако визуально было заметно, что размер размороженных органоидов был меньше, чем у интактных в соответствующий день дифференцировки. В среднем, потеря объёма органоидов составляла 14,5%. Можно также заметить, что наименьшая потеря объёма после разморозки произошла у органоидов, замороженных на 29 день дифференцировки (3,7% объёма), а наибольшая – на 43 день (25,4% объёма). Это может говорить о значительной потере поверхностного слоя клеток после разморозки, а также о лаг-фазе (вероятно, это период стресса), в результате которой органоид в течение какого-то времени после разморозки не увеличивается в размере. Из рис. 3Е видно, что лаг-фаза в случае медленной криоконсервации после разморозки составляет примерно 6-7 дней, с учётом потери поверхностного слоя клеток, независимо от криосреды. По прошествии ещё одной недели размеры органоидов существенно увеличивались, что говорило о возобновлении клеточного деления и продолжении дифференцировки. Тем не менее, размер органоидов по-прежнему оставался меньше нормы в соответствующий день дифференцировки. Скорость роста после лаг-фазы при этом, в среднем, совпадала со скоростью роста у интактных органоидов. Исключением были только органоиды, замороженные на 9 и 29 день дифференцировки: по прошествии лаг-фазы скорость роста размороженных органоидов превзошла скорость роста интактных органоидов, а размер достиг нормы для соответствующего дня дифференцировки.

Таким образом, после разморозки нейрональные органоиды по прошествии 6-7-дневной лаг-фазы, теряют объём за счёт поверхностного слоя, а затем возобновляют рост со скоростью, сравнимой со скоростью роста интактных органоидов.

Экспрессия нейрональных маркеров через 2 недели после разморозки

Через 2 недели после разморозки органоиды делили на 2 части: первую часть лизировали для последующего анализа экспрессии нейрональных маркеров методом qPCR (рисунок 4), а вторую часть фиксировали, а затем окрашивали срезы для флуоресцентной микроскопии (рисунки 5, 6).

Органоиды, замороженные на разных временных этапах культивирования, демонстрировали различные уровни экспрессии генов маркерного нейронального белка, ассоциированного с цитоскелетом, MAP2 и маркерного белка промежуточных филаментов нейроэпителиальных прогениторных клеток Nestin (рис. 4). При этом в случае МАР2 уровни экспрессии в органоидах, подвергшихся заморозке как в FBS, так и в DMEM, были различны в зависимости от стадии культивирования, на которой образцы были криоконсервированы. В интактных органоидах, не подвергавшихся криоконсервации, мы наблюдали сложную динамику экспрессии MAP2: начиная от 9 дня дифференцировки она росла и достигала пика на 29 день, однако после снижалась и оставалась на приблизительно одном уровне вплоть до 2-х месяцев от начала дифференцировки. Динамика экспрессии MAP2 в размороженных органоидах, в целом, повторяла таковую в интактных, так же достигая пика на 29 день дифференцировки, даже несмотря на лаг-фазу. Интересно, что в период с 29 по 43 день дифференцировки экспрессия MAP2 у размороженных органоидов была в среднем ниже, чем у интактных в соответствующий день дифференцировки, однако в период от 43 по 57 день в размороженных органоидах произошёл скачок экспрессии MAP2. Мы не заметили существенной разницы экпрессии MAP2 в зависимости от состава криосреды. Органоиды, замороженные в среде на основе DMEM и FBS, демонстрировали схожий уровень экспрессии данного белка.

Динамика экспрессии Nestin была схожа в органоидах опытных групп, но существенно отличалась от динамики экспрессии Nestin в интактных органоидах. Так, в органоидах, не подвергавшихся заморозке, мы наблюдали два пика экспрессии Nestin: на 16-ый и 29-ый день дифференцировки. В то же время, в размороженных органоидах пики экспрессии Nestin не были столь выраженными. Стоит отметить, что в опытных группах органоидов Nestin в целом экспрессировался на более низком уровне по сравнению с контрольной группой за исключением экспериментальных точек криоконсервации на 22 и 43 сутки. Как и в случае с MAP2, экспрессия Nestin в размороженных органоидах не зависела от состава криосреды. По-видимому, решающее значение имела стадия, на которой замораживались нейрональные органоиды.

       Мы детектировали иммунореактивность антител к нейрональному белку микротрубочек бета-3-тубулину и ядерному антигену пролиферирующих клеток PCNA во всех органоидах контрольной и опытных групп с помощью иммуногистохимического анализа (рис. 5). В то время как бета-3 тубулин синтезировался примерно на одинаковом уровне во всех изучаемых группах, присутствие PCNA было не таким выраженным в органоидах, криоконсервированных в среде на основе FBS, а также в органоидах, замороженных позднее 16 суток культивирования (22, 29 и 43 сутки) в криосреде на основе DMEM.

Мы также наблюдали присутствие МАР2 и транскрипционного фактора SOX2 во всех изучаемых группах (рис. 6), однако в группе органоидов, замороженных в среде на основе FBS, SOX2-положительных клеток было тем больше, чем выше срок культивирования, на котором проводилась криоконсервация. В группе же органоидов, размороженных в DMEM, наоборот, мы наблюдали более низкую интенсивность флуоресценции в образцах заморозки от 22 и 43 суток в отличие от таковых от 16 и 29 суток. МАР2 синтезировался примерно на одном уровне как в контрольной, так и в опытных группах.

Оценка выживаемости хондросфер и экспрессия хондроцитарных маркеров в хондросферах через 2 недели после разморозки

Хондросферы были заморожены в криосреде с 8% ДМСО на основе DMEM. После разморозки мы наблюдали компактизацию хондросфер в течение 14 суток. Так, на 14 сутки сфероиды самоорганизовались в конгломерат (рис. 7). Тем не менее, несмотря на компактизацию, распада хондросфер не происходило, что говорит о выживании хондросфер после разморозки. Также, в отличие от нейросфер, мы не наблюдали уменьшения диаметра отдельных хондросфер и потерю поверхностного слоя клеток. Чтобы подтвердить пригодность использованной среды для криоконсервации хондросфер, мы провели ИГХ анализ экспрессии хондроцитарных маркеров до заморозки и через 2 недели после разморозки.

При анализе результатов ИГХ окрашивания на маркеры, характерные в норме для хондроцитов – SOX9, аггрекан и коллаген II типа (рис. 8). Флуоресценция наблюдалась в случае аггрекана и коллагена в препаратах как до криоконсервации, так и после разморозки. В то время как присутствие SOX9 отмечали только после разморозки. Маркерный белок пролиферирующих клеток PCNA не обнаруживался в анализируемых образцах сфероидов. Вероятно, это связано с низким пролиферативным потенциалом хондроцитов, сформировавших сфероид и подверженных контактному торможению, так как PCNA обнаруживается только в активно делящихся клетках. Это коррелирует с отсутствием изменения размера отдельных хондросфер в процессе культивирования в динамических условиях как до, так и после разморозки.

Обсуждение

Оптимизация протоколов криоконсервации органоидов в настоящее время является важной биомедицинской задачей. Основными критериями успешной криоконсервации являются сохранение жизнеспособности и функциональной активности органоидов после разморозки в течение длительного времени. В данном исследовании использовались протоколы медленной заморозки для нейрональных и хондроцитарных органоидов.

Нейрональные органоиды заднего мозга демонстрировали ряд изменений в процессе культивирования после разморозки в различных средах и на различных стадиях. В частности, наблюдались лаг-фаза 7-10 дней, в течение которой органоиды не увеличивались в размерах, а также потеря поверхностного слоя клеток в мозговых органоидах. Уменьшение размеров таких органоидов примерно на 10% и наличие лаг-фазы, по-видимому, характерны для метода медленной заморозки [27–29]. Тем не менее, данные для нейрональных органоидов немногочисленны и неоднозначны. Так в случае медленной заморозки с использованием ДМСО в качестве криопротектанта авторы наблюдали небольшое увеличение размеров нейрональных органоидов [13]. Потеря наружного слоя органоидов являлась критической только в случае начальных стадий дифференцировки, когда размеры органоидов были сравнительно малы, однако криоконсервация не влияла на пролиферативный потенциал клеток. В то же время, более зрелые нейрональные органоиды демонстрировали большую выживаемость после разморозки. По сравнению с литературными данными, уменьшение концентрации ДМСО в нашем эксперименте положительно влияло на выживаемость нейросфер [12]. Основа криосреды, при этом, значительно не влияла на выживаемость.

Также, независимо от криосреды, сохранялась и экспрессия нейрональных маркеров. Динамика экспрессии MAP2 в размороженных нейрональных органоидах в целом не отличалась от таковой в интактных, несмотря на лаг-фазу. Интересно, что по литературным данным, экспрессия MAP2 в норме должна была повыситься через месяц и два месяца дифференцировки, однако в текущем эксперименте мы, взяв меньшие временные интервалы между измерениями, наблюдали более сложную динамику [30, 31].

В то же время, экспрессия Nestin, исходя из литературных данных, не меняется при использовании криосреды на основе сыворотки или питательной среды [12]. Однако в нашем эксперименте мы проследили более длительную динамику экспрессии. Снижение экспрессии плюрипотентного маркера Nestin свидетельствует переходе нейросфер в более «зрелое» состояние по мере культивирования. При этом, отличие экспрессии Nestin в размороженных нейросферах от экспрессии в интактных наблюдалось на 29 день культивирования (т. е. при заморозке на 14 день от начала дифференцировки), причём независимо от криосреды. По-видимому, этот период являлся критическим для экспансии нейрональных предшественников, а стресс, вызванный разморозкой, поспособствовал резкому дозреванию [32].

Распределение экспрессии нейрональных маркеров MAP2 и TUBB3, а также пролиферативного маркера PCNA в размороженных органоидах в целом соответствовало норме практически на всех стадиях дифференцировки. Это свидетельствует о том, что стресс, вызванный потерей наружного слоя органоидов, не повлиял на организацию цитоскелета в клетках нейрональных органоидов. Важно отметить, что криоконсервация органоидов на поздних стадиях дифференцировки, когда размер органоидов превышал 1 мм в диаметре, не вызвала некроза в кортикальной части. Следовательно, метод медленной заморозки позволяет достаточно равномерно охладить клетки органоида по всему объёму и не допустить кристаллизации воды. Распределение экспрессии SOX2 в размороженных органоидах была схожа с таковой в интактных практически на всех стадиях дифференцировки. Однако органоиды, замороженные в среде на основе FBS на 43 день дифференцировки демонстрировали повышенную экспрессию SOX2, причём SOX2⁺ клетки были расположены хаотично, а не организованы в «розетки», выстилая полость вторичных структур. Так как SOX2, в том числе, связан с пролиферацией и репарацией, вероятно, его экспрессия повысилась в связи со стрессом, связанным с разморозкой [33, 34]. Аналогичной картины в тот же день дифференцировки для нейрональных органоидов, замороженных в криосреде на основе DMEM, не наблюдалось. Напротив, экспрессия SOX2 была распределена как в незамороженном контроле. Исходя из этого, логично предположить, что такой скачок экспрессии связан непосредственно с составом криосреды. В литературе аналогичные эффекты не описывались [12, 13]. Кроме того, повышенная экспрессия SOX2 и его хаотичное распределение в нейрональных органоидах ассоциирована с нарушением межклеточных взаимодействий [35–37]. Исходя из вышесказанного, в данной точке, по-видимому, произошло спонтанное нарушение развития органоидов после разморозки, а полученный результат для этой точки является скорее артефактом.

Подводя итог, из совокупности полученных результатов, оптимальной стадией для криоконсервации нейрональных органоидов является 3-4 неделя от начала дифференцировки. В этом случае мы наблюдали минимальные повреждения, связанные с криоконсервацией и максимальную выживаемость, а быстрое восстановление морфофункциональных характеристик. При этом, основа криосреды не играла значимой роли для криоконсервации.

По результатам проведенного исследования на нейрональных органоидах, нами была выбрана оптимальная среда для заморозки – DMEM +10% FBS + 8% ДМСО. Данную среду мы использовали для криоконсервации хондросфер. Выбранный состав среды оказался оптимальным для замораживания данных структур – все сфероиды выжили после оттаивания. При этом потерь клеток с поверхностных слоёв не наблюдалось, что может говорить о большом количестве межклеточных контактов в 3D-структуре. Кроме того, о повышенной адгезивной способности сфероидов можно судить по образованию единого конгломерата на 14 сутки культивирования после оттаивания. Данный эффект может быть обусловлен компонентами внеклеточного матрикса, который, активнее синтезируется в 3D условиях культивирования, поскольку данный процесс является механозависимым [38, 39].

Классическими маркерами зрелых хондроцитов гиалиновго хряща являются аггрекан и коллагены, экспрессия которых оставалась сохранной после разморозки [40]. Появление после цикла замораживания-оттаивания экспрессии SOX9, который является маркером хондрогенеза и активно представлен в клетках-предшественниках хондроцитов, может быть обусловлено осмотическим и температурным стрессом, который претерпевали клетки [41, 42].

PCNA в первую очередь, играет важную роль в процессах репликации ДНК [43]. Отсутствие данного маркерного белка для пролиферирующих клеток мы связываем с тем, что в процессе культивирования в динамических 3D условиях клетки переходят от активной пролиферации к усиленному синтезу компонентов внеклеточного матрикса. Данная гипотеза согласуется с повышенной адгезионной способностью клеток внутри хондросфер и сфероидов между собой.

Известно о попытках замораживать целые кусочки биопсии хрящевой ткани. Описанные в литературе подходы приносили переменные результаты, которые оказались достаточно противоречивы [44, 45]. Показано, что витрификация не оказывает отрицательного влияния на механические свойства хряща и может использоваться в качестве альтернативы свежим аллотрансплантатам, которые ограничены временем хранения [46]. Хондросферы являются довольно сложной клеточной структурой и для подобных биологических объектов отработанного на практике протокола заморозки не существует. Решение данной проблемы может облегчить транспортировку хондросфер из лаборатории в клинические центры, поскольку срок хранения готового клеточного продукта составляет на более 2 суток [47].

Заключение

Органоиды имеют широкий спектр приложений – от тестирования новых терапевтических агентов in vitro до использования в клинике. Прикладное значение и распространенность данной технологии требует масштабирования и влечёт за собой создание биобанков. В этой связи стандартизация протоколов криоконсервации таких сложноорганизованных структур, как нейрональные органоиды и хондросферы, является актуальной задачей фундаментальной и трансляционной медицины. Наше исследование предлагает простой, воспроизводимый и эффективный протокол криоконсервации органоидов, который, несомненно может быть усовершенствован в будущем.

About the authors

Anna A. Barinova

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Author for correspondence.
Email: barinova.anna.al@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-1212-8154
SPIN-code: 1955-4313
Russian Federation, Moscow, Russia

Polina A. Golubinskaya

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: polinapigeon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1765-9042
SPIN-code: 5299-9693

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

Arina S. Pikina

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: arina.pikina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8967-2318
SPIN-code: 8654-7318
Russian Federation, Moscow

Evgenii S. Ruchko

Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences

Email: ruchkoevgeny@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1361-666X
SPIN-code: 7220-6031
Russian Federation, Moscow

Artem V. Eremeev

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

Email: art-eremeev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3428-7586
SPIN-code: 4825-5440

PhD; Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files