The tendention in creative tissue engineering of osteoplastice

Abstract

In this papier there are basic requirements for materials which are intended for compensation of defects of bones by means of their implantation, and also there are approaches for choosing the sources and technical receptions in industrial manufacture. The dates about approbation in experiment of osteoplastic materials of INDOST, which are developed in compliance with this criterions are shown.

Full Text

Остеопластические материалы, представляющие собой композиции ортофосфатов кальция, коллагена, полисахаридов и других биополимеров, широко используются в стоматологии, челюстно-лицевой и восстановительной хирургии [1-3]. В ортопедии и травматологии они все чаще составляют альтернативу дистракционному остеосинтезу [4, 5]. После имплантации в костный дефект эти материалы способствуют репаративной регенерации окружающей ткани, собственно говоря, организуют ее, полностью деградируя, как бы выполняя роль строительных лесов. За эти свойства подобные материалы и методы их применения были названы, используя кальку с английского термина, соответственно скаффолд-материалами (или просто скаффолдами) и скаффолд-технологиями. Медицинское материаловедение в части разработки таких материалов активно развивается, в соответствии с чем рынок практически ежегодно озвучиваются новые названия [6-8], что создает определенные трудности у практикующего врача при их выборе.

Между тем, давно сформулированы важнейшие свойства, которыми должны обладать остеопластические материалы, предназначенные для имплантации в костный дефект: 1) биосовместимость - хорошая переносимость тканями и отсутствие реакций отторжения и воспаления; 2) биодеградация - по выполнении своей функции они должны быть полностью удалены посредством галистереза и клеточной резорбции; 3) остеоиндуктивность - способность возбуждать остеогенез в месте имплантации материала; 4) пористость, обеспечивающая проникновение клеток и сигнальных молекул, прорастание кости; 5) возможность стерилизации без изменения качеств; 6) доступность и низкая цена [9, 10].

Применяемые в настоящее время скаффолд-материалы принадлежат к различным классам химических соединений, среди которых органические и минеральные вещества, синтетические [полилактат и полигликолат] и биогенные [хитозан, альгинат, коллаген, гетерополисахариды] полимеры [1-3]. Представляется очевидным, что пунктам 1 и 2 наиболее соответствуют соединения, являющиеся естественными составляющими костной ткани: кристаллический и аморфный ортофосфаты кальция, коллаген I типа, хондроитинсульфат. Эти соединения не вызывают изменения кислотно-щелочного баланса в месте имплантации, иммунной, аллергической, воспалительной реакции и наиболее часто используются как компоненты материалов, создаваемых за рубежом [«Geistlich», Швейцария; «Merk» Германия; «Bioteck», Италия и др.] и в России [НПО «ПОЛИСТОМ», «Конектфарм», «Интермедапатит» и др.].

Однако известно, что ни коллаген, ни гидроксиапатитне обладают прямым остеоиндуцирующим эффектом [9, 10]. Для осуществления этой функции они вначале должны привлечь и удержать циркулирующие в крови остеиндуцирующие вещества и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки [ММСК], способные костеогенной дифференцировке. Если развить сравнение, давшее название таким материалам, - это строительные леса, на которых еще нет ни рабочих, ни инструмента (рис. 1).

Рис. 1. Механизм остеорепарации при имплантации двукомпонентной тканеинженерной системы

Работа по совершенствованию этих компонентов остеопластических материалов направлена, главным образом, на изменение их сорбционных свойств в отношении емкости, селективности и устойчивости к биодеградации. В отношении ортофосфатов эти задачи выполняются путем изменения их фазового и элементного состава.

Коллаген, напротив, нуждается в повышении устойчивости к деградации после имплантации в костный дефект, что может быть достигнуто повышением числа межфибриллярных поперечных сшивок в предназначенном для этого материале. Главными функциями коллагена в тканеинженерных системах являются образование трехмерной объемной матрицы, доступной для заселения полипотентными клетками, и удержание этих клеток [адгезии] при посредстве неколлагеновых белков костной ткани [НБК], аффинных к коллагену и этим клеткам. Если первую из этих функций с успехом могут выполнять другие полимерные соединения - хитозан, альгинат, - то в выполнении второй - коллагену соперников нет. Поиски материалов, образующих трехмерную матрицу, пригодную для заселения пролиферирующими полипотентными клетками, продолжаются. Недавно в таком качестве были успешно апробированы резорбируемые полигидроксиалканоаты [ПГА] - линейные полиэфиры бактериального происхождения [11, 12].

Естественно предположить, что введение в скаффолд-материал сигнальных молекул (факторов роста), обладающих остеоиндуцирующими свойствами, их способность возбуждать костеобразование существенно возрастет (рис. 2). При этом композиция из нескольких факторов (проявляющих свое действие в разных фазах клеточного цикла, способствующих, помимо костеобразования, ангиогенезу и гемопоэзу) предпочтительнее одного фактора, даже обладающего высокой биологической активностью. Дело за выбором таких сигнальных молекул, которые имели бы сродство к коллагену и ортофосфатам кальция, образуя с ними недиссоциирующий супрамолекулярный комплекс. Мы полагаем, что в этом отношении перспективно включение в композиции остеопластических материалов костных рострегулирующих факторов [КРФ].

Рис. 2. Механизм остеорепарации при имплантации тканеинженерной системы с включением рострегулирующих факторов: КФР - костные рострегулирующие факторы

Способность деминерализованного костного матрикса к ускорению регенерации кости (к тому, что в настоящее время называют остеоиндукцией) была впервые обнаружена, по-видимому, Senn в 1889 году [цит. по 10]. Однако потребовалось почти 100 лет, чтобы выделить из костной ткани фактор белковой природы, ответственный за остеогенную активность, названный костным морфогенетическим белком [13]. Как показали последующие работы ряда исследователей в России и за рубежом, скелетные ткани являются источником целого ряда полипептидов, модулирующих функциональную активность клеток костной ткани, то есть являющихся КРФ. Они могут выступать как системные агенты и действовать через ауто/паракринные механизмы [14-17].

Понизить уровень неопределенности в области представлений о гуморальной регуляции остеогенеза стало возможным благодаря тому, что в последние два десятилетия достигнуты значительные успехи как в препаративной и аналитической химии НБК, так и в исследовании их биологических свойств. В частности, показано, что, будучи минорной фракцией зрелой компактной костной ткани (не более 3% от массы сухой обезжиренной кости, рис. 3), они представляют собой весьма гетерогенную группу. Последовательное применение нескольких процедур экстрагирования и фракционирования экстракта позволяет получить более 4 десятков НБК, отличающихся между собой по молекулярной массе, сродству к анионо- и катионообменникам, растворимости, характеру биологического действия [18]. Среди КРФ обнаружены ß-трансформирующий фактор роста и относящиеся к тому же семейству цитокинов морфогенетические белки кости, факторы роста фибробластов кислый и основный, инсулиноподобные факторы роста, колониеобразующие факторы гранулоцитов и макрофагов, интерлейкины [19].

Рис. 3. Апроксимированный состав зрелой компактной костной ткани: ГАГ - глиазаминогликаны; НБК - неколагеновые белки кости

Помимо способности регулировать пролиферацию, дифференцировку и экспрессию тканеспецифических белков остеогенными клетками, у КРФ были обнаружены и другие свойства, важные при конструировании остеопластических материалов [20]. Во-первых, способность прочно связываться с минералом и коллагеном кости. Специфическая сорбция удерживает около 25 мг НКБ на 100 г гидроксиапатита. Костный коллаген обладает значительно меньшей емкостью сорбции (в ~3,5 раза) при большей селективности: более 60% десорбированного с коллагенового матрикса НКБ при электрофорезе представляет собой синглетный пик в зоне ß-глобулинов.

Во-вторых, привлекать полипотентные клетки в костный дефект, заполненный материалом, содержащим КРФ. В цепи событий, развивающихся при возмещении костного дефекта, важное место занимает хемотаксис - привлечение в очаг костеобразования клеток-предшественников кроветворения и остеогенеза. Способность одной из фракций НБК выполнять функцию фактора хемотаксиса была протестирована путем имплантации подкожно мышам линии СВА измельченного диссоциативно экстрагированного костного органического матрикса [контроль] и такого же матрикса, предварительно инкубированного в растворе фракции НБК (опыт). Через 2 нед. было обнаружено, что частицы матрикса в контроле и опыте окружены клеточным валом, причем при уровне достоверности 95% в опыте на 1 мм длины окружности частицы общее количество клеток в 2 раза превосходило контроль за счет моноцитов-макрофагов и фибробластоподобных клеток при меньшей доле неизмененных и деградирующих лимфоцитов.

Вместе с тем, среди пептидных фракций, выделенных из костного матрикса, были обнаружены факторы, угнетающие репаративный остеогенез, увеличивающие исходный костный дефект за счет резорбции прилегающих к имплантированному материалу тканей, а также факторы, обладающие провоспалительным эффектом, вызывающие явления альтерации и экссудации в области имплантата, привлекающие иммунокомпетентные клетки. Это обстоятельство, на наш взгляд, компрометирует использование в качестве остеопластических материалов нативной костной ткани, декальцинированного костного матрикса, тотальных препаратов НБК. Очевидной является необходимость предварительного препарирования на молекулярном уровне исходного продукта - источника КРФ, включаемого в остеопластические материалы.

На рис. 4 приведены доводы pro et contra при выборе таких источников в плане вышеизложенных требований при организации промышленного производства остеопластических материалов. Понятно, что в настоящее время эта альтернатива решается в пользу ксеногенной кости - костной ткани крупного рогатого скота, получаемой на предприятиях пищевой промышленности с соблюдением всех санитарных требований. Однако необходимо минимизировать ее основной недостаток, что может быть достигнуто удалением на подготовительных этапах подавляющей части НБК, обладающих антигенными свойствами, но не влияющих (или препятствующих) на остеоиндуцирующую способность [рис. 5]. В условиях современного производства медицинских материалов это вполне достижимо при использовании различных модификаций методов препаративной химии белков.

Рис. 4. "Древо принятия решений" при выборе источника КРФ

Рис. 5. Схема выделения композиции КРФ из ксеногенной костной ткани

Используя изложенные в настоящем сообщении теоретические положения и технические подходы, в Научно-производственном объединении «ПОЛИСТОМ» была разработана и запущена в производство серия остеопластических материалов с общим названием ИНДОСТ [7], которые представляют собой варианты уже выпускавшихся композиций гетерофазного фосфата кальция и коллагена I типа [2], модифицированных включением в их состав комплекса КРФ, выделенного из костной ткани крупного рогатого скота. Формы этих материалов, предназначенные для выполнения различных клинических задач, различны: гранулы, губка, пластины, гель.

Материалы ИНДОСТ прошли испытания на цитотоксичность in vtro с использованием первичной культуры фибробластов человека, которые были выделены из кожномышечной ткани эмбриона на сроке 6 нед. С этой целью водная вытяжка из материала ИНДОСТ-пластины (или физиологический раствор в контроле) была добавлена в лунки планшета, в которые перед этим на сутки были высеяны клетки (плотность посева 35 тыс/см²). Для оценки влияния на жизнеспособность использовали МТТ-тест, основанный на реакции восстановления желтого метилтетразолиумтетрабромида (МТТ) до пурпурного формазана в результате жизнедеятельности (дыхательной активности) клеток.

Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной коровьей сыворотки и 100 Ед/мл пе- нициллин/стрептомицина в атмосфере 5% СO₂ Для визуализации клеток и оценки их жизнеспособности использовали метод окрашивания 0,0002% раствором акридинового оранжевого в фосфатном буфере.

Проводили также апробацию нового материала в экспериментах по возмещению дефектов костей - плоских (ветвь нижней челюсти) или трубчатых (бедренная, большеберцовая), дырчатых (транскортикальная перфорация диаметром 2 мм) или тотальных (резекция диафиза в средней трети с диастазом между отломками 2-3 мм), у лабораторных животных (крыс линии Вистар) при соблюдении норм содержания, вмешательства и выведения из опыта. На этапах экспериментов проводили морфологические исследования новообразованной ткани в месте имплантации испытуемого материала, некоторые результаты которых мы приводим для иллюстрации основных положений настоящего сообщения.

При испытаниях in vitro было обнаружено, что при культивировании фибробластов на материале ИНДОСТ-пластины, последний: а) не содержит водорастворимых компонентов, отрицательно влияющих на жизнеспособность клеток, б) является адгезивным для фибробластов кожи человека, клетки распластываются на поверхности ИНДОСТа. Вместе с тем, на поверхности материала после культивирования в течение 24 ч не отмечалось видимого увеличения количества клеток по сравнению с моментом посева, что, вероятно, связано с миграцией клеток либо с поверхности материала, либо в поры материала.

В экспериментах in vivo клеточным источником репаративного остеогенеза во всех наблюдениях была хорошо васкуляризованная грануляционная ткань в месте имплантации ИНДОСТа [рис. 6]. Реакция со стороны костного ложа была выражена в умеренной остеокластической резорбции, что способствовало интеграции старой и новообразованной ткани [рис. 7]. Резорбция, однако, могла быть и резко выраженной, сопровождаться всеми признаками асептического воспаления, если в композицию НБК включали фракцию со свойствами монокина [21].

Рис. 6. Грануляционная ткань в диастазе между отломками большеберцовой кости через 7 сут. после имплантации ИНДОСТА в диафизарный дефект. Окраска: гематоксилином и эозином. х100

Рис. 7. 7 сут. после имплантации ИНДОСТа в дырчатый дефект нижней челюсти. Остеокласты (стрелки) на границе имплантата и костного ложа. Окраска: гематоксилином и эозином. х200

Свидетельства остеогенной дифференцировки в виде сети молодых костных балок были выявлены не позже, чем через две недели после создания дефекта и заполнения его остеопластическим материалом (рис. 8 а, б), тогда как в контроле, как правило, дефект был заполнен хрящевой тканью (рис. 9). В итоге к концу срока наблюдения (60-75 сут.) дефект в опыте был заполнен костной тканью, завершившей ремоделирование, о чем, в частности, свидетельствовала высокая степень зрелости коллагеновых волокон органического матрикса (рис. 10 а, б), тогда как в контроле продолжалась адаптивная перестройка новообразованной костной ткани (рис. 11).

Рис. 8. 15 сут. после возмещения дырчатого дефекта ИНДОСТом. Окраска: А - гематоксилином и эозином; Б - пикрофуксином. х200

Рис. 9. Хрящевая ткань в диастазе между отломками большеберцовой кости на 15 сут. после возмещения диафизарного дефекта КОЛАПОЛом. Окраска: реактив Шиффа. х100

Рис. 10. Костная ткань через 75 сут. после имплантации ИНДОСТа в дырчатый дефект. Окраска: А - гематоксилином и эозином. х100; Б - пикрофуксином. х200

Рис. 11. Возмещение дырчатого дефекта бедренной кости, контроль, 75 сут.: А - активно перестраивающаяся новообразованная кость. Окраска гематоксилином и эозином. х200; Б - изоформы коллагена различной степени зрелости. Окраска пикросириусом. х100

Скорость биодеградации имплантированного материала зависела от состава и дисперсности его минеральной составляющей: при использовании частиц размером -100 мкм при соотношении гидроксиапатит-трикальций фосфат 7:3 его базофильно окрашиваемые фрагменты могли быть обнаружены через 30 сут. после имплантации (рис. 13), тогда как нанодисперсный минерал (ГА-ТКФ 5:5), взвешенный в коллоидной матрице, не определялся уже через 10 сут. после его имплантации в дырчатый дефект (рис. 12). Через 2-2,5 месяца после имплантации частицы ИНДОСТа не были обнаружены, в какой бы физической форме он ни использовался.

Рис. 12. 30 сут. после возмещения дырчатого дефекта ИНДОСТом, содержащим ГА и ТКФ в виде частиц ~ 100 мкм. Окраска гематоксилином и эозином. х100

Таким образом, в настоящее время имеются теоретически обоснованные и технически осуществимые возможности создания новых тканеинженерных систем для остеопластики с повышенной способностью возбуждать репаративный остеогенез при имплантации в костный дефект. Освоено производство таких систем в виде материалов с различными физическими свойствами, обеспечивающими возможность возмещения врожденных и приобретенных дефектов трубчатых и плоских костей.

Авторы выражают благодарность проф. Н.А. Слесаренко, профессору А.С. Григорьяну и с.н.с. И.И. Селезневой за помощь в выполнении и интерпретации результатов морфологических исследований при экспериментальной апробации остеопластических материалов.