Production of induced human pluripotent stem cells

Full Text

В настоящее время активно ведутся исследования в области получения плюрипотентных соматических клеток животных и человека. Принципиально описаны два пути, посредством которых это может быть достигнуто: использование методов клонирования (например, клеточного слияния, переноса ядер соматических клеток в овоцит второго деления мейоза (somatic cell nuclear transfer, SCNTJ] [1-3] и индукция репрограммирования с получением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced pluripotent stem cells, iPS cells], сходных с ЭСК [4-7]. К настоящему времени уже получены iPS клетки мышей [7], а методом SCNT клонирован целый ряд животных от грызунов до приматов [1-3]. Предпринимались попытки получения плюрипотентных клеток, сходных с ЭСК человека, посредством слияния соматических и эмбриональных клеток. Однако данная методика приводила к формированию популяций тетраплоидных гибридных клеток, свойства которых не в полной мере соответствовали стандартным характеристикам ЭСК [8].

Концентрирование интересов клеточных технологов вокруг исследований, связанных с выделением совместимых плюрипотентных клеток, обусловлено возможностью использования их в моделировании и изучении заболеваний человека, открытии, тестировании и совершенствовании лекарственных препаратов, биологически активных веществ, а также для терапевтического применения при большом спектре заболеваний [5].

Одновременно 20 ноября 2007 года S. Yamanaka и J.A. Thomson в on-line версиях журналов Cell и Science, соответственно, опубликовали материалы исследований по получению iPS клеток человека. В этих работах индукцию плюрипотентности производили на разных клеточных культурах и сравнивали полученные клетки между собой и с контролем - ЭСК человека. S. Yamanaka использовал взрослые дермальные фибробласты, веретеновидные синовиоциты и неонатальные фибробласты крайней плоти, a J.A. Thomson - фетальные и неонатальные фибробласты.

Схема репрограммирования предполагает внедрение в клетки исходной культуры дифференцированных клеток генов плюрипотентности, сверхэкспрессия которых призвана вернуть дифференцированную клеточную популяцию к плюрипотентному состоянию. В качестве индукторов репрограммирования К. Takahashi и S. Yamanaka в 2006 году предложили квартет транскрипционных факторов, выявленных ими из 24 претендентов: Oct4, Sox2, с-Мус, Klf4 [7], который и был использован ими в описываемой работе. 0ct4 и Sox2 являются ключевыми факторами регуляции пролиферации и полипотентности стволовых клеток и характеризуются высоким уровнем экспрессии в ЭСК, снижающимся в процессе дифференцировки [9]. Вовлечение Klf4 и с-Мус в процессы репрограмиирования может быть связано с их ролью в качестве модификаторов хроматина, способствующих активации Cct4 и Sox2. В свою очередь, J.A. Thomson с коллегами на начальном этапе исследования выбирали гены, необходимые для инициации репрограммирования, из 14 кандидатов. В результате была осуществлена замена Klf4 и с-Мус, входящих в стандартный набор транскрипционных факторов «стволовости», на Nanog и Lin28. Роль Nanog, наряду с Cct4 и Sox2, общепризнанна в индукции плюрипотентности соматических клеток [9, 11], тогда как существенная значимость Lin28 в репрограммировании подтверждена не была. Однако необходимость замены с-Мус представляется вполне целесообразной. Выявлена его негативная роль, заключающаяся в индукции апоптоза ЭСК человека [12], а также стимуляции в 20% случаев опухолевой трансформации iPS клеток мышей при реактивации соответствующей области ретровирусного вектора [13]. Интересно, что в исследовании S. Yamanaka были внесены некоторые изменения в методику индукции плюрипотентности, не использованные в работе J.A. Thomson. В частности, были предприняты мероприятия для повышения эффективности использования пула ретровирусов: фибробласты предварительно трансдуцировались лентивирусными векторами, которые содержали гены мышиных рецепторов для ретровирусов - Slc7a1. Это повысило эффективность дальнейшего введения векторов с 0ct3/4, Sox2, с-Мус, Klf4 на 60%. Кроме того, особенностью работы S. Yamanaka является использование с седьмого дня культивирования среды, обогащенной bFGF, который стимулирует пролиферацию ЭСК человека.

В исследованиях селекция культур iPS клеток проводилась на основании морфологического соответствия ЭСК человека (компактность колоний, высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, четкая визуализация ядер]. Иммунофенотип полученных клеток в обоих исследованиях соответствует фенотипу ЭСК человека - показана экспрессия SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81. Методом ПЦР с обратной транскрипцией продемонстрирован характерный для ЭСК высокий уровень экспрессии эндогенных Cct4 и NANCG. К тому же S. Yamanaka с соавт. оценили экспрессию и других генов-маркеров ЭСК человека - REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4, hTERT, указав на дополнительное соответствие полученных в работе культур.

В исследованиях было показано демитилирование цитозингуаниндинуклеотидных последовательностей промоторных областей генов NANQG и Qct4 в подтверждение их высокой функциональной активности, что характерно и для ЭСК человека. В контроле [исходные культуры фибробластов] данные области находились в метилированном состоянии.

Для определения потенциала к дифференцировке ІР8 клетки культивировали в условиях, необходимых для формирования эмбриоидных тел [14], нейронов и кардиомиоцитов. Положительные результаты были достигнуты обеими научными лабораториями, однако S. Yamanaka привел более подробный спектр иммуноцитохимических и генетических характеристик. В его исследовании клетки характеризовались позитивной реакцией на маркеры, характерные для клеток эктодермального [ßlll-tubulin, GFAP], мезодермального [α-ВМА, desmin,] и энтодермального [AFP] происхождения. Методом ПЦР с обратной транскрипцией выявлена экспрессия эктодермальных [МАР2, РАХ6], энтодермальных [box А2, cytokeratin 8, 18, SGX17] и мезодермальных [MSX1, BRACHYURY] генов. Экспрессия маркеров нейронов [ßlll-tubulin, AADC, LMX1B, тирозингидролаза, холинацетилтрансфераза] и кардиомиоцитов [ТпТс, MEF2C, MYL2A, MYHCB, NKX2.5] была обнаружена у дифференцированных производных всех колоний iPS клеток. J.A. Thomson с соавт., также отмечая способность iPS клеток к дифференцировке в различных направлениях, подробного описания результатов иммуноцитомического и генетического анализов не привёл.

Для подтверждения полипотентного статуса в исследованиях выполнялась подкожная трансплантация iPS клеток. В местах инъекций развивались «тератомы», состоящие из комплекса тканей, морфологически сходных с производными всех трех зародышевых листков. Однако J.A. Thomson указывает на неоднородность дифференцировочных потенций среди исследуемых культур. В частности, в «тератомах» в 50% случаев отсутствовал нейрональный компонент, также не наблюдалась экспрессия LIN28 в четверти колоний репрограммированных как фетальных, так и неонатальных фибробластов.

Несмотря на ряд различий в материалах, методиках и обоснованиях полученных данных, глобальным результатом исследований двух независимых групп ученых явилось получение ІР8 клеток человека, сходных по морфологическим, иммуногистохимическим и генетическим критериям с ЭСК человека. Это является первым значительным достижением в области получения аутогенных плюрипотентных клеток путем репрограммирования соматических клеток человека. По мнению редакции журнала Science получение iPS-клеток человека является вторым из наиболее значимых научных открытий 2007 года [15]. На получении и исследовании iPS-клеток сосредотачивается внимание уже нескольких ведущих лабораторий мира. К исследовательским группам, возглавляемые S. Yamanaka, R. Jaenisch и A. Thomson, присоединилась группа G. Daley, чья статья об успешном получении iPS-клеток человека вышла в декабре в on-line версии журнала Nature [16].

About the authors

I. Ya. Bozo

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files