Isolation of umbilical cord blood stem cells using an automatic functionally closed Sepax system

Abstract

Umbilical cord blood (PC) is used as a source of hematopoietic stem cells (HSCs) for transplantation in the treatment of a number of hematological and hereditary diseases.

Full Text

Пуповинная кровь (ПК) используется в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для проведения трансплантации при лечении ряда гематологических и наследственных заболеваний. Существуют различные методы процессирования пуповинной крови для уменьшения общего объема, удаления эритроцитов, тромбоцитов и сохранения максимального количества гемопоэтических прогениторных клеток. Цель данного обзора - показать результаты обработки пуповинной крови на автоматическом сепараторе Sepax (Biosafe), представляющим собой мобильную и компактную систему с многочисленными протоколами для выделения стволовых клеток из ПК, мобилизированной периферической крови и костного мозга. Закрытая система расходных материалов включает в себя сепарационную камеру вариабельного объема, что позволяет обработать любой объем исходного образца, мешки для сбора плазмы и эритроцитов, а также возможно наличие криомешка на 25 мл для фракции buffy-coat (комплект расходных материалов CS-530, CS-540). Один из многочисленных дизайнов расходных материалов представлен на рис. 1.

Рис. 1. Пример дизайна расходных материалов

Первые экспериментальные работы по оценке данного аппаратного метода были проведены в 1999 г. в гематологической лаборатории Медицинского Университета г. Басле (Швейцария) [1]. Было обработано 10 образцов ПК по протоколу «UCB» v.110 без использования дополнительных седиментирующих агентов. ПК поступала в сепарационную камеру, подвергалась центрифугированию. Разделение компонентов ПК происходило в соответствии с их размером и плотностью. Далее компоненты последовательно экстрагировались в соответствующие мешки для сбора, лейкоконцентрат поступал непосредственно в криомешок. Наличие оптического сенсора и набора клапанов позволяло точно контролировать процесс экстракции. Принцип сепарации показан на рис. 2. Время прохождения процедуры 15 мин. Среднее значение уменьшения объема ПК составило 70%. Полученные данные представлены в табл. 1.

Таблица 1

Среднее значение	До процедуры	После процедуры	Выход
Объем (мл)	98 (68-116)	29 (16-43)	30% (22-37)
Кол-во ядросодержащих клеток (х107)	104 (73-139)	66 (25-113)	74% (33-83)
CD34+ клетки (х105)	23,4 (9,3-33,3)	19,1 (6,5-41,6)	92% (66-100)

Затем были опубликованы исследования отделения трансфузиологии Медицинского центра г. Эрланген (Германия) [2]. Выход ядросодержащих клеток составил 78,3±15,6%, мононуклеаров - 74,7±30,7% и CD34+ - 87,1±28,0%.

Далее полноценное исследование 630 образцов ПК провели в Испании (Centro De Galicia, Santiago de compostela) [3]. В качестве седиментирующего агента использовали гидроксиэтилкрахмал. Редукцию объема ПК проводили до 21 мл по протоколу «UCB-HES» v.160. Полученные данные представлены в табл. 2.

Рис. 2. Принцип сепарации

Таблица 2

N=630	Объем после процедуры, мл	Кол-во ядросодержащих клеток до процедуры, х109	Кол-во ядросодержащих клеток после процедуры, х109	Выход ядросодержащих клеток, %	Удаление эритроцитов, %	Гематокрит
Значение	21,2	1,21	1,09	81,9	77,0	31,4
Среднее	21,3	1,10	0,87	82,2	79,8	32,0
Стандартное отклонение	0,79	4,39	3,78	8,05	11,91	9,89

Сравнительные данные по обработке ПК с гидроксиэтилкрахмалом автоматическим методом по протоколу «UCB-HES» v.160 и ручным по методу Рубинштейна [4] были проведены Бельгийским банком пуповинной крови [5]. Результаты работы представлены в табл. 3.

Таблица 3

	Sepax	Ручной процесс	Улучшение
Количество образцов	452	671
Начальный объем, мл	99,8±22,0	95,3±23,3	+4,5 мл
Конечный объем, мл	21,8±0,66	21,7±0,80	+0,1 мл
Восстановление, % Кол-во ядросодержащих клеток Мононуклеары	87,8±10,2 87,5±10,5	80,5±9,1 80,1±9,1	+7,3% +7,4%
Уменьшение, % Эритроциты	82,5±8,8	74,5±7,7	+8,0%

Таким образом, автоматический метод позволяет достичь высокого выхода ядросодержащих клеток в конечном продукте, с небольшим улучшением показателей относительно ручной сепарации. Содержание прогениторных клеток более 90% от начального количества. Конечный продукт характеризуется высокой жизнеспособностью - 97% и низким гематокритом, что в конечном итоге будет означать высокую жизнеспособность после размораживания. Элиминируется риск микробиологической контаминации и потери образца. Дополнительным преимуществом автоматизации является значительное сокращение времени процедуры до 35 мин (протокол «UCB-HES») по сравнению с ручным методом - 2 ч 30 мин, также увеличивается воспроизводимость результатов и возможна стандартизация отчета о проведении процедуры. Пример распечатки данных о процедуре приведен на рис. 3.

Рис. 3. Бланк с результатами процессинга пуповинной крови

Аппарат Sepax (рис. 4) прежде всего интересен Банкам ПК, где есть заинтересованность к хранению большого количества образцов на минимальной площади.

Рис. 4. Внешний вид аппарата Sepax