Autogenic IL-10 modified dendritic cells in immune therapy of multiple sclerosis: the first clinical experience

Full Text

Введение

Рассеянный склероз CPC) — самое распространенное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы, поражающее преимущественно лиц молодого трудоспособного возраста и быстро приводящее к инвалидизации. По распространенности среди всех форм неврологической патологии PC занимает четвертое место после церебральных инсультов, эпилепсии и паркинсонизма, а среди лиц молодого возраста прочно занимает второе место сразу после эпилепсии. В настоящее время в мире насчитывается более 2 млн больных PC, в том числе в России их более 220 тыс. [1].

PC является мультифакторным заболеванием, развитие которого обусловлено взаимодействием факторов внешней среды, вероятно, вирусной природы, и наследственной предрасположенности, реализуемой полигенной системой, включающей особенности иммунного ответа и определенный тип нейрометаболизма [2].

Основу патогенеза PC составляет аутоиммунная агрессия на антигенные структуры центральной нервной системы (ЦНС), прежде всего, на основные белки и гликоликопротеиды миелина, «изолирующего» аксональные структуры и обеспечивающего проведение нейрональных имульсов. Результатом этой агрессии, сопровождающейся изменениями клеточного и гуморального звеньев иммунитета, становится формирование в ЦНС очагов демиелинизации, т.н. бляшек. Данные изменения обуславливают развитие очаговых неврологических расстройств, характерных для PC. Важно отметить, что одновременно с процессом демиелинизации по краям бляшки в ряде случаев могут идти процессы ремиелинизации, обуславливающие ремиттирующее течение заболевания, однако, чаще всего они выражены незначительно и восстановление миелиновой оболочки по интенсивности и скорости несопоставимо с ее распадом. Запущенные патологические процессы крайне редко самостоятельно поддаются обратному развитию, приводя к стойкой инвалидизации больных молодого возраста, что, учитывая высокую частоту заболеваемости, становится в настоящее время существенной медицинской и социальной проблемой [3].

Значимость проблемы PC усугубляется недостаточной эффективностью всех известных на сегодняшний день методов его лечения. Используемая иммуномодулирующая терапия отличается очень высокой стоимостью, необходимостью длительного [практически постоянного] ее применения и эффективна менее чем у половины больных PC. Все это обуславливает потребность в поиске новых более действенных методов лечения [4], одним из которых может стать использование для терапии PC дендритных клеток (ДК).

ДК — специализированные мигрирующие антигенпредставляющие клетки, обладающие свойством модуляции направления созревания Т-лимфоцитов и, соответственно, играющие активную роль в формировании иммунного ответа.

В настоящее время основной целью исследований ДК является создание клеточных вакцин, способных корректировать иммунный статус как у больных со злокачественными опухолями, так и аутоиммунными заболеваниями. Итогом этих исследований стало: накопление свидетельств о вовлечении ДК в процесс формирования периферической Т-клеточной толерантности; появление технических возможностей генерации in vitro большого числа толерогенных ДК; понимание основных механизмов иммунной толерантности, индуцированной ДК [5]. Все это, а также применение ДК-вакцин в онкологии позволило начать клинические исследования, основной целью которых стала оценка возможности и эффективности применения ДК в терапии PC, как одного из аутоиммунных заболеваний [6].

Определение общей стратегии, а также детальная разработка протокола введения ДК больным PC были выполнены на основе опыта работы научной группы X. Линка из департамента Neurotec Каролинского института (Стокгольм, Швеция) [5, 7] и отделения биотерапии и трансплантации костного мозга НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (В.М. Моисеенко, И.А. Балдуева) [8—10].

Иммунотерапию PC было решено проводить аутогенными IL-10-модифицированными незрелыми ДК [11-13], способными подавлять иммунный ответ на антигены через уменьшение экспрессии костимулирующих молекул, интерферона γ (IFN-γ), снижение выработки антител, формирование клонов регуляторных Т-клеток с супрессивной активностью (IL-10- или TGF-β-продуцирующихТг1- и Тh3-клеток, CD4⁺CD25⁺ Т-клеток) [14—17].

Таким образом, в основу исследования легло положение о том, что нивелирование ДК иммунной агрессии на антигены миелина должно способствовать ремиссии заболевания, а при наличии процессов ремиелинизации — улучшению неврологического статуса больного.

Материал и методы

Под наблюдением находился больной Б., 46 лет, страдающий PC с февраля 1998 г. До июня 2000 г. отмечалось рецидивирующе-ремиттирующее течение заболевания, далее — вторично-прогрессирующее. Медленное прогрессирование заболевания, зарегистрированное с 2000 г. сопровождалось периодическими обострениями, которые купировались метипредом. С 2002 г. пациент находился под наблюдением в клинике нервных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Неоднократно (в среднем — 2 раза в год) получал курсы сосудорасширяющей (Трентал), антиоксидантной (липоевая кислота, витамины группы В) и нейропротективной (Церебролизин, ПК-мерц) терапиибез явного положительного эффекта.

С ноября 2004 по октябрь 2006 г. проходил курс лечения специфическим препаратом для лечения PC Копаксоном — без явного клинического эффекта (без снижения частоты обострений и скорости прогрессирования PC). При обострении пациент получал кортикостероиды (Метипред) по 1000 мг в/в кап. в течение 5 сут. с незначительным и нестойким положительным результатом. Степень тяжести заболевания перед включением в исследование — 6 баллов по шкале EDSS.

В 2007 г. больному на основании решения этического комитета Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова была рекомендована терапия IL-10-модифицированными незрелыми ДК.

Получение незрелых ДК

ДК выращивали из моноцитов периферической крови больного при 37°С, 5% С0₂ и 98% влажности в обогащенной бессывороточной среде для выращивания ДК (CellGro DC) («Cell Genix», Германия) в присутствии стабильного содержания гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и IL-4 («Cell Genix», Германия) в течение 5 сут. и IL-10 с 5 по 7-е сут. Моноциты получали из адгезивной фракции мононуклеаров, выделенных в градиенте плотности фиколла-верографина «Lympholyte» («Cedarlane Lab. Ltd», Канада) (удельная плотность 1,077 г/см³) по методу A. Boyum (1968).

Мононуклеары (3—4×10⁶/мл) помещали в культуральную среду «CellGro DC» с GM-CSF (800 U/ml), IL-4 (500 U/ml) и плоскодонные культуральные флаконы площадью 65 см² («Sarstedt», Германия). С целью предотвращения контаминации клеточных культур использовали пенициллин (50 ЕД/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл). Наблюдение проводили за клетками, прикрепившимися в течение первых 2-х часов культивирования. Неприкрепившиеся клетки удаляли. На 5-е сут. добавляли IL-10 (конечная концентрация 10 нг/мл) и культивировали еще 2 дня для получения IL-10-модифицированных ДК.

Данная методика позволяла получать из 60 мл периферической крови 2,5-4×10⁶ незрелых ДК (CD11c⁺ HLA DR⁺CD1a⁺CD83⁺CD83^-CD80^-) (рис. 1).

 

Рис. 1. Иммунофенотип клеток, полученной культуры

 

Иммуноцитохимическая характеристика ДК

Для иммуноцитохимической оценки полученных ДК проводили цитологическую и иммунологическую верификацию ДК, изучали тип роста клеток. ДК выращивали на стеклах, фиксировали с помощью абсолютного метанола, окрашивали моноклональными антителами к линейным антигенам миелоидных клеток, моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, незрелых, зрелых и активированных ДК (CD11c, CD14, CD3, CD19, CD20, CD16, CD56, HLA DR, CD1a, CD83, CD80 («DAKO» Дания, «Novocastra», Великобритания) с помощью непрямого иммуноцитохимического метода и системы визуализации «In vision» и «Novostain detection kit NCL-RTU-D» («DAKO» Дания, «Novocastna», Великобритания].

Оценка стерильности полученной культуры ЦК

Контроль стерильности проводили после приготовления вакцины по методике, изложенной в Сборнике инструкций, утвержденных приказом Минздрава СССР от 13.01.83 г. № 31. Культура ДК была стерильна.

Введение больному аутогенных ДК

Аутогенные ДК вводились больному вначале однократно (06.12.07 г.], затем, через 4 мес. После оценки индивидуальной реакции больного была выполнена серия из 3-х введений с интервалом 1 мес. (31.03.08 г., 29.04.08 г., 26.05.08 г.].

Перед введением больному ДК (2,5—4×10⁶) их отмывали в 0,9% растворе NaCI, центрифугировали (1000 об/мин, 10 мин) и вводили extempore по 0,3 мл паравертебрально в межпопаточную область в 3 точки на расстоянии 3 см с образованием «лимонной корочки». В четвертую точку (контрольную) вводили изотонический раствор NaCI с 10% раствором альбумина человека.

Оценка токсичности полученной культуры ДК

Контроль токсичности проводили в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ. Основные жизненные параметры (общее состояние, пульс, АД) измеряли через 10, 30 и 60 мин после каждого введения культуры ДК. Особое внимание уделялось местным кожным реакциям, лихорадке, гастроинтестинальной и гематологической токсичности, а также функции печени, почек и нервной системы. Введенные ДК оказались безвредными и нетоксичными для больного.

Иммунологический мониторинг

Контроль за состоянием иммунной системы больного выполнялся посредством ее мониторингового наблюдения. Взятие крови проводили в день введения ДК, через 15 и 42 дня после введения, затем в день начала серии из 3-х введений ДК (116-й день от первого введения ДК) и далее через 42, 70 и 91 сут. после него (соответственно, на 158-е, 186-е и 235-е сут. от первого введения ДК).

Проводился анализ спонтанной и индуцированной продукции цитокинов, а также содержания их в сыворотке крови с использованием отечественных тест-систем, основанных на «сандвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Применялись тест-системы на IL-8, рецепторный антагонист интерлейкина 1 (IL-1ra) и IFNγ, производства ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, тест-системы на IL-1, IL-2, IL-4, IL—6, IL—10, фактор некроза опухоли α (TNFα) и интерферон α, (IFNα) производства ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург. В качестве индукторов использовались РНА-Р (Sigma, США) в дозе 10 мкг/мл (IL-2, IL-4, IL-10, IFNγ), пирогенал в дозе 50 мкг/мл (TNFα,, IL-1, IL-1 га, IL—8, IL-6), вирус болезни Ньюкастла с инфекционным титром 8 Ig ЭИД/0,2 мл в объеме 10 мкл на лунку (IFNγ, IFNα).

Содержание иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови анализировалось методом турбодиметрии.

С помощью иммуноферментного анализа определялось содержание в сыворотке крови фактора роста нервов (BDNFα) (Chemicon Int., США) и аутоантител к основному белку миелина (ОБМ) (ТОО «Навина», Москва).

Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови исследовалась в реакции бласттрансформации в цельной крови с помощью ДНК-цитометрии с учетом результатов на проточном цитометре EPICS XL (Beckman—Coulter, США). В качестве митогенов применялись РНА-Р в концентрации 15 мкг/мл (преимущественно — Т-клеточный митоген) и митоген лаконоса в концентрации 5 мкг/мл (преимущественно — В-клеточный митоген). В качестве специфического антигена — основной белок миелина (ОБМ) (Sigma, США).

Цитотоксическая активность натуральных киллерных клеток анализировалась на выделенных мононуклеарах с помощью ДНК-цитометрии с учетом результатов на проточном цитометре EPICS XL (Beckman—Coulter, США). В качестве клеток-мишеней были использованы клетки перевиваемой клеточной линии К—562.

Субпопуляционный состав лимфоцитов исследовался методом проточной цитометрии (Cytomics FC500, Beckman—Coulter, США) в цельной крови с использованием следующих моноклональных антител в многоцветном анализе: CD45, CD3/CD4/CD8, CD3/CD(16⁺56⁺), CD19/CD5, HLA DR, CD4/CD25/CD127, CD16/CD95 (Beckman—Coulter, США).

Результаты и обсуждение

Оценка влияния терапии ДК на клинические проявления PC с использованием стандартизированной шкалы оценки неврологического статуса (EDSS) и шкалы оценки функциональных систем (FS) Дж. Курцке (1983) не позволила выявить каких-либо значимых изменений в процессе пилотного исследования. В конце января 2008 г. во время острого респираторного заболевания пациента с умеренной гипертермией (до 37,6°С) отмечено недолгое (до 2 нед.) обратимое повышение степени тяжести по EDSS до 6,5 баллов, что было расценено как «псевдообострение». Данное состояние купировалось самостоятельно. Каких-либо токсических или других побочных эффектов терапии на организм пациента не выявлено. Местные умеренные кожные реакции (покраснение и зуд) регрессировали без лечения в течение 3—5 сут.

При оценке иммунологического статуса больного в динамике количество лейкоцитов в процессе наблюдения не выходило за границы нормативных значений. Относительное количество лимфоцитов колебалось в пределах нижних значений нормы, абсолютное — характеризовалось лимфопенией.

Во все сроки наблюдения относительное количество зрелых Т-лимфоцитов соответствовало норме, тогда как относительное количество Т-хелперов (CD4⁺) превышало, а относительное количество цитотоксических (CD8⁺) лимфоцитов было значимо ниже референтных значений. Как следствие, был увеличен иммунорегуляторный индекс (ИРИ).

Относительное количество «дубль»-позитивных Т-лимфоцитов (CD4⁺CD8⁺) в период наблюдения соответствовало норме.

Абсолютное и относительное количество регуляторных Т-лимфоцитов (CD4⁺CD25⁺CD127^-) в процессе терапии аутогенными IL-10-модифицированными ДК увеличилось более чем в 2,5 раза (рис. 2).

 

Рис. 2. Динамика числа Т-регуляторных лимфоцитов (CD4⁺CD25⁺CD127^-)

 

Относительное количество натуральных киллеров (CD3^-CD16⁺), активированных NK-клеток (CD3^-CD8⁺), количество T-NK (CD3⁺CD16⁺CD56⁺), оставаясь в пределах референтных значений, характеризовалось тенденцией к увеличению (рис. 3).

 

Рис. 3. Динамика относительного числа NK-клеток (CD3^-CD16⁺), активированных NK-клеток (CD3^-CD8⁺), T-NK-клеток (CD3⁺CD16⁺CD56⁺)

 

Относительное количество В-клеток не выходило за границы нормы и характеризовалось тенденцией к снижению, тогда как количество аутореактивных клонов В-лимфоцитов (CD19⁺CD5⁺), исходно соответствующее верхней границе нормы, к концу наблюдения увеличилось вдвое (рис. 4).

 

Рис. 4. Динамика относительных значений числа аутореактивных клонов В-лимфоцитов (CD19⁺CD5⁺)

 

За время наблюдения отмечался высокий уровень содержания в сыворотке IgG. После первого введения культуры ДК наблюдалось повышение в сыворотке уровней IgA, IgM, IgG, возможно, связанное с респираторной вирусной инфекцией, имевшейся в тот период у больного. При серийном введении культуры ДК определялась тенденция к снижению уровня иммуноглобулинов до первоначальных значений (рис. 5).

 

Рис. 5. Динамика содержания IgM, IgG, IgA в сыворотке крови

 

Увеличенный уровень аутоантител к ОБМ класса М и соответствующий верхней границе нормы уровень аутоантител класса G на фоне введения культуры ДК снизились до значений популяционной нормы. Затем произошел их подъем, что также, возможно, связано с респираторной вирусной инфекцией. Серийное введение культуры ДК привело к прогрессирующему снижению уровня аутоантител к ОБМ до значений популяционной нормы, сохранявшемуся и через 2 мес. после последнего введения культуры ДК (рис. 6).

 

Рис. 6. Динамика уровней IgM и IgG к основному белку миелина

 

Уровень продукции в головном мозге BDNFα, до начала ДК терапии был средневысоким. После первого введения культуры ДК в течение 4 мес. отмечалось нарастание его продукции. Серийное введение культуры ДК сопровождалось колебаниями его продукции от высокой до умеренной степени (рис. 7).

 

Рис. 7. Динамика уровня фактора роста нервов BDNF

 

Пролиферативный ответ в трехсуточной реакции бласттрансформации на ФГА (фитогемагглютинин), преимущественно действующий на Т-лимфоциты, характеризовался тенденцией к снижению. К концу наблюдения он уменьшился почти в 2 раза, а ответ на PWM (митоген лаконоса), преимущественно влияющий на В-клетки, снизился почти в 6 раз (рис. 8).

 

Рис. 8. Динамика пролиферативной активности лимфоцитов с митогенами

 

Отмечалось повышение пролиферативного ответа лимфоцитов на ОБМ в 7-суточной культуре как после первого, так и после серийного введения ДК. Данный факт может быть косвенным свидетельством наличия в периферической крови пациента аутореактивного клона лимфоцитов, экспрессирующих рецептор к ОБМ (рис. 9).

 

Рис. 9. Динамика пролиферативной активности лимфоцитов со специфическими антигенами

 

Имевшее место снижение спонтанной и индуцированной продукции IL-1β сочеталось в ходе наблюдения с увеличением как спонтанной продукции, так и содержания в сыворотке IL-1ra.

Сниженная индуцированная продукция INFα, не изменялась в процессе наблюдения. Спонтанная продукция и содержание в сыворотке INFγ, TNFα, характеризовались чередованием подъемов и снижений, тогда как индуцированная продукция этих цитокинов снижалась.

Увеличенный уровень спонтанной продукции и содержания в сыворотке IL-4 нормализовались к концу наблюдения. Увеличенный уровень спонтанной продукции IL-10 сочетался со снижением резервных возможностей синтеза и содержания в сыворотке этого цитокина (рис. 10).

Заключение

Таким образом, введение под кожу в область спины аутогенных IL-10-модифицированных ДК в дозе 3×10⁶ не вызвало каких-либо побочных отрицательных реакций у больного с вторично-прогрессирующим течением PC.

Ответ иммунной системы на введение культуры этих клеток был достаточно разноплановым, с участием Т- и В-клеточных звеньев. При этом наиболее значимым стало снижение титра антител к ОБМ, которое вкупе с относительным и абсолютным увеличением в периферической крови количества Т-регуляторных лимфоцитов (CD4⁺CD25⁺CD127^-) может расцениваться как проявление формирования у больного иммунотолерантности к этому белку.

Кроме того, у больного появились признаки активации продукции факторов роста нервов, что позволяет в будущем надеяться на частичную ремиелинизацию очагов поражения ЦНС и, соответственно, восстановление некоторых утраченных функций.

Курс инъекций аутогенных IL-10-модифицированных ДК не привел к значимому изменению клинического и неврологического статуса у больного с вторично-прогрессирующим течением PC, также как и проводимые ранее другие виды терапии.

Полученные данные позволяют считать целесообразным дальнейшее проведение клинического испытания предложенного метода клеточной иммунотерапии с целью определения его переносимости, безопасности и эффективности в лечении больных PC.

About the authors

M. M. Odinak

S.M. Kirov Military Medical academy

Author for correspondence.
Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

V. S. Chirsky

S.M. Kirov Military Medical academy

Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

G. N. Bisaga

S.M. Kirov Military Medical academy

Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

I. A. Baldueva

N.N. Petrov Research Institute of Oncology

Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

V. M. Moiseenko

N.N. Petrov Research Institute of Oncology

Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

Т. L. Nekhaeva

N.N. Petrov Research Institute of Oncology

Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

N. M. Kalinina

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine

Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

N. I. Davydova

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine

Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

N. V. Bychkova

Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine

Email: bozo.ilya@gmail.com
Russian Federation, Saint Petersburg

C. Ciumas

Epilepsy Research Center

Email: bozo.ilya@gmail.com
France, Lyon

References

Supplementary files