Increase of adaptive reserves of the damaged myocardium to load tests after intramyocardial transplantation of various phenotypes of bone marrow stromal cells

Full Text

Стромальные клетки костного мозга (СККМ) вследствие высокого пролиферативного потенциала, способности к дифференцировке в миогенном и эндотелиальном направлениях являются перспективным материалом для восстановления сократительной функции поврежденного миокарда [1, 2]. В ряде экспериментальных работ были исследованы эффекты интрамиокардиальной трансплантации кардиомиоцитоподобных, эндотелиоцитоподобных и недифференцированных стромальных клеток костного мозга в поврежденный миокард [3-10]. Было показано, что пересаженные клетки переживают после трансплантации, улучшают сократительную функцию миокарда, стимулируют ангиогенез. Однако в этих работах не оценивались адаптационные резервы сократительной функции миокарда после трансплантации клеток. Кроме того, вследствие различий в моделях повреждения миокарда, методах культивирования, количестве трансплантированных клеток, способах трансплантации провести сравнительный анализ степени терапевтической эффективности используемых клеточных препаратов в подавляющем большинстве работ не представлялось возможным. Поэтому большое значение приобретают исследования, где в сходных условиях эксперимента сравниваются терапевтические эффекты различных типов клеток, так как только такие работы позволяют ответить на вопрос о целесообразности предифференцировки клеток для восстановления тканеспецифических структур миокарда [4, 5, 10]. Настоящее исследование было предпринято с целью сравнительного изучения влияния аутогенных СККМ различного фенотипа на

насосную функцию и адаптационные резервы левого желудочка (ЛЖ) после его криодеструкции (КД) в условиях повышенных пред- и постнагрузок, а также для получения ответа на вопрос о целесообразности предифференцировки клеток для восстановления тканеспецифических структур миокарда.

Материал и методы

Опыты выполнены на 40 взрослых крысах-самцах породы Вистар массой 300-400 г. Животные были разделены на 4 группы: 1-я группа - контрольная, крысы с криодеструкцией (КД) миокарда и введением в принекротическую зону физраствора (10 животных, «контроль»); 2-я группа - крысы с КД и введением в принекротическую зону аутогенных недифференцированных стромальных клеток костного мозга (нСККМ) (10 животных); 3-я группа - крысы с КД и введением в принекротическую зону аутогенных предифференцированных в кардиомиоцитоподобном направлении СККМ (кСККМ) (10 животных); 4-я группа крысы с КД и введением в принекротическую зону аутогенных предифференцированных в эндотелиоцитоподобном направлении СККМ (эСККМ) (10 животных).

Операции проводили в условиях комбинированного наркоза (ксилазолин 10 мг/кг в/м и эфир ингаляционно) и интубационной искусственной вентиляции легких.

КД выполняли с помощью металлического стержня цилиндрической формы диаметром 6 мм, охлажденного в жидком азоте, путем прикладывания его к передне-боковой поверхности левого желудочка (ЛЖ) на 0,5 мин. После оттаивания стенки ЛЖ процедуру КД повторяли 10 раз.

Костный мозг получали путем пункции большеберцовых костей. Аспират обрабатывали гипотоническим раствором для лизиса эритроцитов. Полученные клетки культивировали в среде DMEM (Sigma), содержащей 10% FBS (HiClone) в термостате при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 95% влажности. Среду меняли каждые 3 сут., элиминируя неприкрепившиеся ко дну культуральной посуды клетки. Через 6-7 сут. культуру рассевали в соотношении 1:2, используя 0,25% раствор трипсина. Далее клетки культивировали тремя способами. Для получения культуры нСККМ клетки культивировали до получения 90% монослоя. Для получения культуры кСККМ в культуру на 2 суток добавляли 5-азацитидин (Sigma) в концентрации 6 мкмоль/л и культивировали до получения 90% монослоя. Для получения культуры эСККМ клетки культивировали до получения 90% монослоя, после чего среду меняли на DMEM low glucose (Sigma), содержащую 2% FBS и 50 нг/мл VEGF (rat) (Sigma) и культивировали в течение 7 суток [1]. Для трансплантации клетки снимали с пластика, используя 0,25% раствор трипсина.

Принадлежность трансплантируемых СККМ к определенному фенотипу подтверждали иммуноцитохимической окраской культур клеток на виментин, тропонин 1, фактор фон Виллебрандта [11-13].

Трансплантацию клеточного материала проводили в количестве 5±1,2´10⁶ клеток, ресуспендированных в 100 мкл физраствора, инъекционно в 5 точек принекротической зоны через 7 сут. после КД.

Исследование насосной функции сердец проводили через 3 недели после трансплантации. Оценку насосной функции ЛЖ проводили в стендовых условиях по модифицированной методике Neely [14], которая позволяет количественно оценивать аортальный, коронарный, минутный объемы (АО, КО и МО соответственно) перфузионного раствора (ПР), ЧСС, систолическое, диастолическое давления (СД, ДД) в устье аорты, а также рассчитать ударный объем ПР (УО), долю АО в МО, развиваемое давление (РД=СД-ДД), время систолы, скорость нарастания давления во время систолы (dP/dt). При этом имеется возможность менять пред- и постнагрузку на ЛЖ (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема установки для изучения сократительной функции ЛЖ изолированного сердца

 

Для исследования животное наркотизировали эфиром, в условиях ИВЛ извлекали сердце, помещали в холодный (+4°С) ПР, в течение 2 мин. канюлировали аорту и начинали перфузию по Langendorff оксигенированным ПР при +37°С, затем канюлировали левое предсердие. После 5 мин. ретроградной перфузии через аорту начинали подавать ПР в левое предсердие. Наше исследование насосной функции изолированных сердец заключалось в последовательной смене 5 режимов нагрузки на ЛЖ (табл. 1), осуществляемых за 30-35 мин. Исследование насосной функции сердец начинали с преднагрузки на ЛЖ 10 см вод. ст., после чего увеличивали преднагрузку (режим 2) путем подъема уровня предсердной камеры с 10 на 20 см (нагрузка объемом). Затем повышали постнагрузку на ЛЖ, увеличивая высоту столба в аортальной трубке с 70 до 100 см (режим 3). В режиме 4 увеличивали постнагрузку на ЛЖ, повышая сопротивление аортальному выбросу сердца за счет присоединения к аортальной трубке наконечника с узким (0,3 мм) просветом. В режиме 5, повторяющем режим 3, оценивали способность ЛЖ к восстановлению показателей насосной функции после режима 4.

 

Таблица. 1. Режимы нагрузочных тестов, использованных для оценки насосной функции изолированных сердец в стендовых условиях

Режим	Преднагрузка, см вод. ст.	Постнагрузка, см вод. ст.	Диаметр аортальной трубки, мм
1	10	70	3
2	20	70	3
3	20	100	3
4	20	100	0,3
5	20	100	3

 

Обработку результатов сравнительного исследования показателей насосной функции сердца осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента и с учетом поправки Бонферрони для множественных сравнений при вероятности ошибки I рода p = 0,05.

Результаты

Наши исследования показали, что сразу после КД на наружной стенке ЛЖ в зоне криовоздействия возникал округлый очаг повреждения темно-вишневого цвета диаметром 6-7 мм, а через 30 дней после КД наблюдалось формирование рубцовой ткани светлого-серого цвета в миокарде переднебоковой стенки ЛЖ округлой формы диаметром 6-7 мм со стороны эпикарда и 3 мм со стороны эндокарда; толщина стенки ЛЖ в центре рубца не превышала 1 мм (толщина стенки ЛЖ у взрослых интактных крыс составляет 4-5 мм) Нами не было отмечено различий в размерах и форме рубца миокарда у животных различных групп.

При изучении насосной функции ЛЖ (объемы, давление и др.) в большинстве опытов нам не удалось получить четкой картины, описывающей закономерности функционирования сердец различных групп. Такую ситуацию мы связали с индивидуальными различиями функционирования ЛЖ в каждом опыте. Чтобы нивелировать эти различия показателей, для анализа результатов были использованы относительные величины, отражающие увеличение/уменьшение показателей при смене режимов. В рамках данной статьи невозможно отразить все полученные числовые данные, поэтому мы ограничиваемся описанием наиболее важных и показательных результатов, отражающих характер функционирования сердец каждой группы.

Во всех исследованных группах сердца адекватно реагировали на преднагрузку и, следовательно, их функционирование подчинялось закону Франка-Старлинга: при увеличении преднагрузки увеличивались МО, КО, АО и УО. Однако увеличение этих объемов имело разную степень выраженности в экспериментальных группах. Например, увеличение АО было наиболее выражено в группах нСККМ и эСККМ (рис. 2).

 

Рис. 2. Прирост аортального объема после увеличения преднагрузки

 

В группе нСККМ увеличение МО было реализовано в основном за счет увеличения ЧСС при одновременном уменьшении времени систолы ЛЖ и сравнительно большого прироста значений КО (рис. 3). В противовес этому, в группе эСККМ наблюдалось небольшое уменьшение ЧСС при одновременном увеличении времени систолы ЛЖ. На фоне сравнительно низких значений прироста КО увеличение МО в группе эСККМ было реализовано преимущественно за счет более значительного увеличения ударного объема. Можно предположить, что у миокарда сердец группы нСККМ, в отличие от миокарда группы эСККМ, имеет место более значительное потребление кислорода, который и оказывает положительное инотропное воздействие. Таким образом, после трансплантации всех типов СККМ сердца были более адаптированы к воздействию преднагрузок, что можно расценить как свидетельство улучшения эластических свойств миокарда ЛЖ.

 

Рис. 3. Прирост коронарного объема после увеличения преднагрузки

 

При увеличении постнагрузки при практически неизменном МО во всех группах происходило перераспределение АО и КО в пользу КО, однако в группе эСККМ тенденция к малому приросту КО сохранялась. Во всех группах также происходило повышение СД примерно на 20% и ДД примерно на 50%. Также во всех группах, кроме кСККМ, происходило снижение показателей dP/dt (показатель, характеризующий сократимость) и увеличение времени систолы на 10%. В целом, в режиме 3 максимально адаптировались сердца группы кСККМ.

Следующим этапом тестирования сердец было применение сверхвысокой постнагрузки при одновременном использовании высокой преднагрузки, что способствовало выявлению максимальных адаптационных резервов миокарда. При этом мы наблюдали снижение АО более чем в 2 раза, которое было менее выражено в группах кСККМ и эСККМ. Также усиливалась перфузия ПР через коронарные сосуды, однако в группе эСККМ приросты КО были меньшими, чем в контроле (p<0,05), а у кСККМ, наоборот, более выраженными. При этом в группе эСККМ значимо снижалась ЧСС, но УО изменялся менее значительно (по сравнению с контролем), и поэтому МО уменьшился примерно так же, как и в остальных группах. Показатели давления еще дополнительно выросли во всех группах примерно на те же величины, что и после применения первого режима преднагрузки. На рис. 4 видно, что сила сокращения была наиболее выражена в группе кСККМ, сердца в которой наиболее полно адаптировались к сверхвысоким преднагрузкам.

 

Рис. 4. Прирост систолического давления во время сверхвысокой постнагрузки

 

Далее мы проводили сравнение показателей одинаковых режимов 5 и 3, отражающих уровень функциональных резервов сердец. АО практически не изменялся во всех экспериментальных группах и выгодно отличался этим от АО контрольной группы, где он падал почти на 20%. Более отчетливо значения АО выразились в показателе доли АО в МО. Он наиболее значительно снизился в контрольной группе (~10%) и достоверно отличался от остальных групп. Кроме того, при сравнении значений доли АО в МО выявились различия в группах с трансплантацией. В группе кСККМ показатель АО/МО остался практически тем же, но в группах нСККМ и эСККМ он вырос примерно на 9%, достоверно отличаясь от группы кСККМ (рис. 5). При этом КО в группах нСККМ и эСККМ уменьшался, тогда как в остальных группах - не менялся (p<0,05). Разница между группами нСККМ и эСККМ заключалась в разном соотношении прироста УО и убыли ЧСС. В группе эСККМ прирост УО составил 24%, убыль ЧСС - 15%, в группе нСККМ - 12% и 3% соответственно. Можно заключить, что трансплантация всех типов клеток повышает переносимость миокардом сверхвысоких постнагрузок: после сверхвысокой постнагрузки мы наблюдали практически полное восстановление систолической функции ЛЖ в этих группах. В группе эСККМ это происходило за счет более эффективной («экономной») перфузии миокарда, в группе кСККМ - только за счет возросшей перфузии миокарда. Несмотря на сохранение уровня перфузии миокарда в контрольной группе, восстановления функции ЛЖ у этих сердец не наступало.

 

Рис. 5. Сохранность доли аортального объема и минутного объема после сверхвысокой постнагрузки

 

Обсуждение результатов

В мире уже накоплен некоторый материал по эффектам трансплантации СККМ на миокард. Например, в работе [3] изогенные кСККМ трансплантировались в окклюзированную аорту крысам после перевязки левой коронарной артерии. По данным эхоКГ в этих опытах улучшался ряд функциональных показателей сердец по сравнению с контролем. В исследовании [6] изучали эффект кСККМ, трансплантированных в геле на поверхность инфаркта после ишемического инфаркта миокарда у свиней. Были констатированы миграция клеток в миокард, улучшение систолической функции, а также ангиогенез.

В работе [7] в зону, связанную с коронарной артерией, обусловившей инфаркт вводили аллогенные нСККМ. В результате происходило сокращение некротической зоны миокарда, нормализация систолической и диастолической функции сердец, исследованной методом магнитно-резонансной томографии. Повышение фракции выброса было подтверждено и в работе [8], где функцию сердца изучали эхокардиографией после трансплантации аллогенных нСККМ, причем, достоверные отличия от контроля стали проявляться только на 3 мес. после трансплантации. В эксперименте на собаках [9] трансплантировали нСККМ. Спустя 30 и 60 дней после трансплантации было показано достоверное увеличение фракции изгнания ЛЖ, уменьшение рубцовой ткани и увеличение плотности сосудов в миокарде у экспериментальной группы.

Oswald et al. (2004) изолировали СККМ крыс, размножили их in vitro и получили эндотелиоподобные клетки [1]. Ангиогенный эффект этих клеток в настоящее время изучен недостаточно полно, а сократительная функция миокарда после их трансплантации в миокард вообще не изучалась; мы впервые описали эти эффекты в настоящем исследовании.

Констатируя довольно большое количество работ по применению СККМ различного фенотипа, мы вместе с тем отметили дефицит исследований, в которых бы проводилось сравнение эффектов трансплантации различных видов СККМ на состояние поврежденного миокарда. Например, в

работе Tomita et al. (1999) [4] на модели КД миокарда были использованы различные виды аутогенных клеток костного мозга: кСККМ, свежевыделенные клетки КМ, нСККМ. Положительный эффект был достоверно подтвержден после трансплантации этих клеток по сравнению с контролем. Это выражалось в уменьшении инфарктной зоны (чего мы не отметили в настоящем исследовании) и в улучшении систолической и диастолической функции, изученных по методике Langendorff. Но достоверных результатов о более эффективном применении какой-либо фракции клеток приведено не было. В другой работе [5] по данным морфометрии постинфарктного ЛЖ показан отрицательный эффект от интрамиокардиальной трансплантации мононуклеарной фракции КМ и положительный - после трансплантации нСККМ. Однако в этих исследованиях не изучались резервы сократительной функции ЛЖ. Также невозможно сделать выводы о необходимости предифференцировки СККМ перед трансплантацией.

В настоящем исследовании, применив методику Neely для изучения сократительной функции миокарда после трансплантации в него различных фенотипов СККМ, мы получили возможность применения дозированных нагрузочных тестов для подробного изучения отличий адаптационных возможностей миокарда, работающего в условиях высоких нагрузок.

Полученные нами данные свидетельствуют о существующих различиях в действии разных фенотипов СККМ. Так, кСККМ потенциально могут применяться для лечения состояний, сопровождающихся снижением фракции выброса ЛЖ, при сердечной недостаточности (ДКМП, постинфарктный кардиосклероз, приобретенные пороки сердца). эСККМ могут найти применение в лечении состояний, когда имеется преходящий дефицит кровоснабжения миокарда (стенокардия напряжения). нСККМ по способу действия занимают промежуточное положение и могут применяться, например, при ишемической кардиомиопатии.

Выводы

1. Исследование насосной функции интактных и поврежденных сердец на стендовой установке в условиях применения дозированных пред- и постнагрузок на ЛЖ позволяет выявить признаки скрытой левожелудочковой недостаточности в криоповрежденных сердцах и признаки ослабления ее при трансплантации в миокард СККМ.
2. Пересаженные в перинекротическую зону аутологичные СККМ при воздействии дозированных пред- и постнагрузок ослабляют признаки левожелудочковой недостаточности и повышают адаптационные резервы миокарда вне зависимости от своего фенотипа.
3. кСККМ повышают резистентность миокарда ЛЖ к нагрузочным тестам преимущественно за счет повышения сократимости и силы сокращения.
4. эСККМ повышают устойчивость миокарда к высоким постнагрузкам, главным образом, за счет повышения эффективности перфузии миокарда.
5. нСККМ по эффективности адаптирующего воздействия на миокард занимают промежуточное положение между кСККМ и эСККМ по показателям сократимости и перфузии миокарда.
6. Выбор направления предифференцировки СККМ клеток перед трансплантацией следует проводить с учетом характера патологических процессов в миокарде: для коррекции сократительной функции предпочтительнее использовать кСККМ, при относительном дефиците кровоснабжения миокарда показано применение эСККМ, при сочетанном поражении целесообразнее трансплантировать нСККМ.

About the authors

I. V. Potapov

Institute of transplantology and artificial organs

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru

Laboratory of stem cell biotechnology

Russian Federation, Moscow

I. A. Kirillov

Institute of transplantology and artificial organs

Email: redaktor@celltranspl.ru

Laboratory of stem cell biotechnology

Russian Federation, Moscow

N. A. Onischenko

Institute of transplantology and artificial organs

Email: redaktor@celltranspl.ru

Laboratory of stem cell biotechnology

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files