Possible pathways of regener ative strategy in correction of type I diabetes mellitus by methods of cell transplantation

Full Text

По современным представлениям, сахарный диабет (СД) I типа - это хроническое аутоиммунное воспаление островков Лангерганса (ОЛ) [1-8], следствием которого является нарушение процессов регенерации, деструкция и гибель b-клеток ОЛ [9, 10] с развитием абсолютной инсулиновой недостаточности и гипергликемии.

Неэффективность процессов восстановительной регенерации в ОЛ в значительной степени обусловлена и поддерживается глубокими нарушениями функций иммунной системы, которая, будучи филогенетически наиболее древней интегративной системой организма, более других ответственна за регуляцию морфогенеза и структурного гомеостаза [11-17].

Реrенерационная способность b-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы

На долю ОЛ приходится около 2% массы поджелудочной железы (ПЖ) и, в отличие от экзокринной части, ОЛ обладают выраженной регенерационной способностью. Существует ряд прямых и непрямых доказательств постоянного обновления b-клеток в ПЖ взрослого человека, которое индуцируется уровнем гликемии и регулируется процессами пролиферации, регенерации и апоптоза [9, 18-20].

Показано, что уже на ранних стадиях СД I типа под действием факторов аутоиммунной агрессии, а также с помощью механизмов апоптоза и некроза [1] наступает гибель большей части b-клеток ОЛ. Возросшую потребность тканей в инсулине организм на начальных этапах пытается компенсировать путем запуска процессов репаративной регенерации и гипертрофии сохранившихся b-клеток, что проявляется временной (до 7-10 месяцев) клинической ремиссией заболевания, известной как фаза «медового месяца» (honeymoon phase) [21, 22]. Частичная клиническая ремиссия заболевания со снижением суточной потребности в экзогенном инсулине описана у 43-80% пациентов с СД I типа [23-25], причем ее механизм связывают с частичным восстановлением секреторной функции b-клеток [26]. Ремиссия при естественном течении заболевания носит, однако, временный характер, так как под воздействием факторов прогрессирующей деструкции b-клетки утрачивают способность пролиферировать со скоростью, равной скорости их гибели, и возникает стадия развернутого клинического течения СД типа.

Между тем, даже на этой стадии драматического снижения пула b-клеток в организме параллельно с процессами гибели инсулин-продуцирующих клеток, некоторые исследователи отмечают косвенные признаки их регенерации и неогенеза. Так, W. Gepts (1965) наблюдал митотическое деление b-клеток в новообразованных ОЛ в одном из 23 аутопсийных исследований ПЖ больных, погибших от СД типа [27]. При резекции сегмента ПЖ, выполненной у 89-летнего больного с СД типа в связи с развитием эпителиальной неоплазии, в свободной от опухоли ткани ПЖ были обнаружены b-клетки, позитивно окрашиваемые антителами к инсулину и Ki-67 - маркеру пролиферативной активности клеток [28]. В практике также описываются единичные случаи полной клинической ремиссии у больных на фоне предсуществующего длительного течения СД типа в анамнезе, что косвенно указывает на возможность полноценной регенерации ОЛ ПЖ [23, 29, 30].

Регенерация b-клеток и ОЛ показана на различных экспериментальных моделях у животных: после частичной резекции ПЖ [31], при перевязке протоков ПЖ [32], введении стрептозотоцина (STZ) и аллоксана [33, 34], в условиях гипергликемии при хронической инфузии глюкозы [35], а также на трансгенных мышах с гиперпродукцией g-интерферона [36] и IL-6 [37].

S. Yamada и I. Kojima (2005) полагают, что неогенез b-клеток и островковых клеток (ОК) в ПЖ, как у новорожденных, так и у взрослых крыс и мышей с СД I типа возникает вследствие следующих механизмов [38]:

• неогенеза b-клеток в сохранившихся ОЛ (за счет дифференцировки внутриостровковых прогениторных/стволовых клеток, а также дедифференцировки соматостатин-содержащих d-клеток);
• пролиферации эпителиальных клеток протоков и их последующей дифференцировки во внеостровковые b-клетки, а также посредством созревания прогениторных/стволовых клеток, локализующихся внутри или вокруг протоков ПЖ;
• дедифференцировки ацинарных клеток и последующей их дифференцировки во внеостровковые b-клетки или неогенеза ОК за счет трансдифференцировки ацинарных клеток;
• репликации и пролиферации b-клеток в сохранившихся ОЛ (рис.).

 

Рис. Возможные механизмы регенерации b-клеток поджелудочной железы. По [39] с изменениями

 

В ряде работ была подвергнута сомнению возможность участия прогениторных клеток ПЖ в процессах новообразования b-клеток и показано, что репликация инсулин- продуцирующих клеток является основным механизмом, поддерживающим численное постоянство b-клеточной массы в постнатальном периоде [40-42].

Однако, более поздние исследования, проведенные S. Bonner-Weir и А. Sharma (2006), доказали, что репликация является не единственным механизмом постнатальной регенерации b-клеток у животных [43]. В ПЖ новорожденных крыс в период с 20-го по 31-й день после рождения авторы наблюдали более чем трехкратное увеличение общего числа b-клеток, при этом 30% новых b-клеток были образованны не в результате их собственной репликации. Также было показано, что после введения BrdU (5-bromo- 2-deoxyuridine), маркера клеточной пролиферации, крысам с 90% резекцией ПЖ в первую очередь позитивная флюоресценция появлялась в области эпителиальных клеток протоков ПЖ [44].

Механизмы образования b-клеток в постнатальном периоде путем их репликации и неогенеза, очевидно, функционируют у всех животных, однако они могут иметь различный вклад у разных видов. У человека компенсаторное увеличение пула b-клеток ПЖ может наблюдаться в условиях высокой инсулиновой резистентности в ответ на ожирение, а также при беременности [19, 45]. Полагают, что в механизмах компенсации b-клеточной массы при ожирении неогенез играет более важную роль, чем репликация [46, 47], так как на гистологических срезах ткани ПЖ людей, страдавших ожирением, очень редко наблюдаются увеличенные в размерах ОЛ, при этом описываются множественные внутридольковые выводные протоки, в составе выстилки которых были обнаружены инсулин-содержащие клетки [43].

На сегодняшний день существует ряд косвенных доказательств того, что в ПЖ взрослого человека может происходить постоянное обновление b-клеточного состава ОЛ [18]. Известно, что апоптоз b-клеток наблюдается в ПЖ не только у больных СД I типа, но и у здоровых людей [45, 47]. В связи с этим, логично утверждать, что параллельно с процессами разрушения эндокринных клеток в норме в ПЖ человека должны протекать процессы регенерации, направленные на поддержание b-клеточной массы на постоянном уровне. Основные терапевтические подходы, основанные на восполнении утраченных b-клеток у больных СД I типа, должны быть направлены на стимуляцию регенерации и восстановление пула b-клеток, а также на ингибирование b-клеточного апоптоза и/или коррекцию иммунных нарушений [1, 4].

В многочисленных экспериментальных работах на животных было показано, что некоторые белки и гастроинтестинальные гормоны могут выступать в качестве терапевтических агентов, способных стимулировать регенерацию b-клеток in vivo. Среди них выделяют: INGАP (протеин гена неогенеза островков) [48], глюкагоноподобный полипептид-1 (GLP-1) и exendin-4 (Еx-4, агонист рецептора GLP-1) [49], сочетание бетацеллюлина (BTС, член семейства ЕGF) и активина А (член семейства TGF-b) [50], а также гастрина и ЕGF (эпидермальный фактор роста) [51]. Применение INGАP, пептидного фрагмента Reg белка ПЖ, приводит к кратному увеличению ОК у мышей с СД I типа [48]. GLP-1/Еx-4 обладают способностью повышать секрецию инсулина, стимулировать репликацию и регенерацию b-клеток, а также ингибировать их апоптоз [49]. В опыте BTС стимулирует пролиферацию b-клеток [50], а активин А и гастрин способствуют дифференцировке b-клеток [52].

Возможность и эффективность применения гормонов и белков для стимуляции увеличения массы b-клеток при СД I типа у человека пока мало изучена. Не так давно были описаны результаты клинического применения INGАP при СД I типа [53]. Несмотря на то, что на фоне проводимой терапии у больных наблюдалось незначительное повышение уровня С-пептида, в целом исследователи не отмечали выраженного клинического эффекта.

Показано, что некоторые факторы роста способны стимулировать in vitro процессы новообразования инсулин-продуцирующих клеток путем запуска процессов репликации b-клеток и дифференцировки дуктальных, ацинарных и прогениторных/стволовых клеток ПЖ. Среди них выделяют: HGF (фактор роста гепатоцитов) [54], ЕGF (эпидермальный фактор роста) [52], IGF-1 или -2 (инсулиноподобный фактор роста-1, 2) [55], TGF-a (трансформирующий фактор роста-альфа) [56]. Несмотря на то, что результаты экспериментальных работ демонстрируют высокую эффективность этого направления, остается много вопросов, которые ограничивают применение рекомбинантных факторов роста с целью получения функциональной массы b-клеток in vitro для последующей клеточной трансплантации. В частности, отсутствуют четкие указания, какой фактор роста, в каких количествах и на каких этапах культивирования клеток ПЖ необходимо использовать. Кроме того, современные методы получения рекомбинатных факторов роста являются крайне дорогостоящей процедурой.

Известно, что новообразованные b-клетки имеют повышенную чувствительность к апоптозу [57, 58]. Следовательно, несмотря на возможность активации процессов репликации и регенерации b-клеток в ПЖ больных СД I типа, на фоне повышенного апоптоза будет происходить постоянная гибель новообразованных b-клеток без увеличения b-клеточной массы. С этой точки зрения регенерационная терапия СД I типа должна быть комплексной и сочетаться с методами, направленными на ингибирование апоптоза и иммунных дизрегуляций [59]. Недавние экспериментальные исследования показали [60], что сочетанное применение лизофиллина - для подавления аутоиммунитета и Еx-4 - для усиления пролиферации b-клеток, приводило к регрессу СД I типа у NOD мышей, что проявлялось снижением гипергликемии до нормальных цифр, повышением секреции инсулина, улучшением метаболизма b-клеток, а также ингибированием их апоптоза. Согласно полученным результатам, эугликемия наблюдалась у животных в течение 5 мес. В другом исследовании [61] мышам линии NOD с аутоиммунным СД подкожно вводили адъювант Фрейнда, после чего проводили внутривенную инфузию донорских сингенных спленоцитов.

Для контроля уровня гликемии проводили трансплантацию аллогенных ОК под капсулу почки. На 40-й день после удаления почки с графтом ОК в экспериментальной группе животных с одновременным введением живых спленоцитов уровень глюкозы оставался на уровне нормогликемии, в отличие от контрольной группы животных с введением облученных спленоцитов, у которых отмечалось нарастание гликемии. Примечательно, что при удалении почки с графтом ОК на 120-й день у животных как в контрольной, так и в экспериментальной группе авторы отмечали длительную реверсию СД на фоне продолжительной нормогликемии, а в ПЖ наблюдалась регенерация b-клеток и ОЛ. Иммуногистохимически было показано, что живые донорские спленоциты мигрируют в область ОЛ, эпителий протоков и экзокринную часть ПЖ, где, по мнению авторов, дифференцируются в b-клетки.

Вместе с тем, в аналогичных работах трех независимых групп исследователей [62-64] было доказано, что регенерация b-клеток и ОЛ не возникает вследствие дифференцировки мезенхимальных спленоцитов, как считалось ранее. Несмотря на то, что исследователям не удалось найти источник регенерации b-клеток и ОЛ в ПЖ экспериментальных животных, ими было высказано мнение, что введение адъюванта приводит к подавлению аутоиммунитета, направленного против b-клеток ОЛ, и выживанию графта донорских ОК в почке. При этом на фоне снижения иммунной дизрегуляции происходит увеличение массы b-клеток за счет собственной пролиферации инсулин-продуцирующих клеток и/или дифференцировки прогениторных/стволовых клеток ПЖ [65].

Таким образом, имеющиеся наблюдения свидетельствуют о том, что развитие и прогрессирование СД I типа часто происходит на фоне сохраняющихся в ПЖ потенциальных резервов регенерации b-клеток, которые, однако, остаются не вовлеченными в процесс репаративной регенерации этих клеток.

Основные подходы к осуществлению регенерационной терапии СД I типа и его осложнений

Успехи в лечении СД I типа и его осложнений, достигнутые при трансплантации аллогенных и ксеногенных ОК ПЖ, вновь подчеркнули актуальность проблем дефицита донорского материала и поиска новых источников получения достаточных количеств функционально активной массы b-клеток для трансплантации.

В связи с этим, в последние годы стали активно разрабатываться и изучаться новые методы регенерационной клеточной терапии, предусматривающие выделение и eх vivo предифференцировку эмбриональных и прогениторных/стволовых клеток ПЖ. Эти клетки обладают более высоким пролиферативным потенциалом, чем зрелые дифференцированные ОК ПЖ и поэтому могут оказаться более пригодным материалом для получения достаточных количеств функционально активной массы b-клеток. Клетки костного мозга и пуповинной крови также являются материалом, пригодным для более выраженной активизации в сохранившихся клетках ПЖ собственного резерва регенерации и пролиферации, а также коррекции аутоиммунных нарушений, лежащих в основе патогенеза СД I типа.

Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы

Терапия СД I типа путем пересадки ОК, выделенных из ПЖ взрослых доноров, разрабатывается уже более 30 лет. По данным Международного регистра трансплантаций ОК ПЖ, за период с 1974 по 2000 г. в мире было выполнено 445 аллогенных трансплантаций ОК [66]. По сравнению с органной аллотрансплантацией ПЖ, полученные результаты были весьма неутешительными, так как из 267 пересадок аллогенных ОК, выполненных с 1990 по 1998 г., период инсулиновой независимости больше 1 года наблюдался лишь у 8% больных с СД I типа [67].

В 2000 году группой А. Shapiro et al. [68] был разработан протокол (the Еdmonton protocol) трансплантации ОК, выделенных из ПЖ двух и более трупных доноров, с применением щадящей схемы иммуносупрессии и без использования глюкокортикостероидов. Согласно данному протоколу, больным СД I типа была выполнена интрапортальная пересадка изолированных ОК в количестве 11000 IЕQ/кг. Поддерживающая терапия включала малые дозы такролимуса с сиролимусом. Индукционная терапия проводилась весь 10-недельный трансплантационный период с помощью блокатора рецептора IL-2 (даклизумаб). Все 7 пациентов (100%) оставались инсулин-независимыми в период наблюдения (в среднем - около 14 мес.) и при этом имели нормальный уровень гликированного гемоглобина. По данным других зарубежных клинических центров, зарегистрированных в Международном регистре трансплантаций ОК ПЖ, процент успешно проведенных операций с достижением инсулин-независимости до 1 года составил 50-80% [69]. За последние 5 лет более чем 471 больному с СД I типа была выполнена аллотрансплантация ОК по Эдмонтонскому протоколу в 43 клиниках по всему миру [70].

Последующее наблюдение за пациентами показало постепенное снижение функции трансплантанта ОК ПЖ. У половины из успешно пролеченных больных с СД I типа период инсулин-независимости наблюдался до 2 лет и только у 7,5% - до 5 лет [71].

Несмотря на положительные моменты в плане поддержания инсулин-независимости у больных СД I типа в течение 1 года и более, следует отметить и отрицательные стороны аллогенной трансплантации изолированных ОК ПЖ: пожизненная необходимость приема иммунодепрессантов, обладающих токсическим действием не только на почки реципиента, но и на трансплантат ОК; отсутствие необходимого числа пригодных донорских органов, что не позволяет выполнить значительное количество таких пересадок. Отсутствие реальной возможности проведения повторных трансплантаций, в том числе из-за их высокой стоимости и возникновения нового хирургического риска, не дает шанса оценить результаты длительного влияния ретрансплантаций изолированных ОК на вторичные осложнения СД I типа [72]. В недавно выполненном клиническом исследовании [73] приведены четкие доказательства возникновения очагового стеатоза печени после интрапортальной трансплантации аллогенных ОК ПЖ.

Показано [74], что графты аллогенных ОК, применяемые у больных СД I типа согласно Эдмонтонскому протоколу, во всех случаях содержали незначительное количество донорских экзокринных клеток и эпителиальных клеток протоков ПЖ. Начиная с 1999 г. авторами этого исследования проводилась оценка клеточного состава трансплантатов аллогенных человеческих ОК, введенных 83 больным СД I типа. Наблюдалась положительная корреляция между количеством пересаженных эпителиальных клеток протоков ПЖ и длительным метаболическим улучшением, которое отслеживали у пациентов путем проведения глюкозо-толерантного теста в течение 2 лет после аллотрансплантации ОК. Было высказано мнение, что эпителиальные дуктальные клетки (прогениторы), находящиеся в аллогенном графте ОК, играют важную роль в увеличении пула b-клеток ПЖ, а также в длительности выживания трансплантанта ОК.

Трудности терапии СД I типа, связанные с отсутствием необходимого числа доноров, пытаются разрешить с помощью ксеногенной трансплантации ОК ПЖ [75]. Большой и многолетний клинический опыт применения гормональноактивных культур ксеногенных ОК ПЖ имеется в ФГУ НИИТ и ИО Росздрава [72, 76]. В качестве донорского материала для клинических трансплантаций используются ОК, выделенные из ПЖ новорожденных кроликов. Согласно полученным результатам, возможность регулярного (каждые 6-12 месяцев) и многолетнего введения пациентам, страдающим СД I типа, культур ОК ПЖ новорожденных кроликов позволяет на многие годы отодвинуть наступление терминальных стадий диабетических ангиопатий, а также снизить гипергликемию и стабилизировать течение лабильных форм СД. По мнению авторов [77], под влиянием пересадки ксеногенных неонатальных ОК может происходить мобилизация пролиферативного пула эпителиальных (прогениторных) клеток протоков собственной ПЖ больных СД I типа и последующая их дифференцировка в b-клетки. Известно, что донорские неонатальные ОК могут продуцировать не только инсулин, но и тканеспецифические пептиды и факторы роста, которые могут стимулировать регенерацию и увеличение пула b-клеток в ПЖ реципиента, тем самым регулируя метаболические процессы в организме [78].

Однако будучи эффективным способом коррекции гипергликемии и вторичных диабетических осложнений, трансплантация ксеногенных ОК ПЖ сталкивается с необходимостью решения ряда дополнительных проблем, таких как несовместимость пары донор-реципиент, которая сокращает сроки терапевтического эффекта, и риск для больного подвергнуться зоонозной инфекции при использование ксеногенного материала [79].

Предварительное получение in vitro инсулин-продуцирующих клеток - производных эмбриональных стволовых клеток

Известно, что эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека плюрипотентны и обладают высоким пролиферативным потенциалом. Получают ЭСК из внутренней клеточной массы (эмбриобласта) донорских эмбрионов на стадии ранней бластоцисты [80].

Ряд экспериментальных работ сообщает об успешных опытах по направленной дифференцировке человеческих и животных ЭСК in vitro в функционально активные инсулин- продуцирующие клетки [81-83]. Авторы используют различные подходы для получения необходимой популяции ЭСК, способной дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки: подбор условий культивирования [83-86]; сверхэкспрессию основных транскрипционных факторов, таких как Pax-4 и Pdx-1 [87-89]; отбор клеток путем трансфекции гена резистентности к антибиотикам, запускаемого под контролем промотора инсулина или Nkx 6.1 [81, 90].

Было показано, что более эффективным способом получения инсулин-продуцирующих клеток является селекция ЭСК, экспрессирующих нестин - промежуточный филаментный маркерный белок нервных стволовых клеток [83, 84, 88, 89]. Данный метод отбора ЭСК был получен в результате модификации протокола, первоначально предназначенного для нейрональной дифференцировки [91], который основывался на том, что нейроны и b-клетки ПЖ в процессе эмбрионального развития могут происходить от общей популяции нестин-экспрессирующих клеток-предшественников. В некоторых исследованиях было показано [84, 87], что введение мышам с СД I типа островковоподобных кластеров клеток, полученных путем дифференцировки ЭСК, экспрессирующих нестин, приводило к снижению у них гипергликемии.

Позже было показано, что большинство инсулин-позитивных клеток, полученных согласно данному протоколу, не синтезировали инсулин de novo и в большинстве случаев экзогенный инсулин концентрировался клетками из культуральной питательной среды, который затем выделялся апоптотическими клетками [92, 93]. Более того, было показано, что полученные инсулин-экспрессирующие клетки имели нейрональные характеристики. Несмотря на то, что дифференцированные клетки были инсулин-позитивными, в них слабо определялась инсулиновая мРНК, а С-пептид, побочный продукт синтеза инсулина, и секреторные гранулы не определялись. В связи с этим стало очевидно, что иммуногистохимическое исследование только инсулина (без демонстрации С-пептида) не является надежным методом определения панкреатической дифференцировки in vitro и лишь применение методов оценки de novo синтеза инсулина с использованием маркировки С-пептида демонстрирует подлинную b-клеточную дифференцировку [92].

Принимая во внимание, что в проведенных исследованиях была показана селекция нестин-позитивных прогениторных клеток, а также тот факт, что нервные стволовые клетки человека в норме способны продуцировать малые количества инсулина [94], возможно, что инсулин в островковоподобных кластерах клеток появлялся в результате аберрантной нейрональной дифференцировки. Тем не менее, эти клетки имеют очень малое внутриклеточное содержание инсулина по сравнению с нормальными инсулин-продуцирующими клетками ПЖ и характеризуются неполной экспрессией маркеров b-клеток. Считается, что методы, основанные на селекции нестин-позитивных ЭСК, являются невоспроизводимыми (в связи с тем, что полученные клетки уже коммитированны к дальнейшей дифференцировке в нервном направлении) и не подходят для дальнейшего получения b-клеток из ЭСК.

Более естественный подход к получению in vitro панкреатических клеток-предшественников и, в конечном итоге, дифференцированных и функционально активных b-клеток основан на начальной коммитированности ЭСК к дефинитивной эндодерме, имитирующей дифференцировку инсулин-продуцирующих клеток in vivo. Данный подход является сложным, так как спонтанная дифференцировка ЭСК in vitro направлена по нейроэктодермальному пути чаще, чем по мезодермальному или эндодермальному пути. С этой точки зрения, потенциально важным является недавнее сообщение о том, что в эмбриональных тельцах возможна активация эндодермального пути дифференцировки при культивировании их в бессывороточных средах с добавлением активина А [95]. Было показано, что культивирование эмбриональных телец, выделенных из ЭСК, в присутствии стадийно-специфической концентрации монотиоглицерола в бессывороточных условиях, приводит к развитию популяции клеток, экспрессирующей инсулин I, инсулин II, Pdx-1 и Sox-17 (эндодермальный маркер) [96]. Иммуногистохимическое исследование показало низкое внутриклеточное содержание инсулина, а его de novo продукция была подтверждена визуально путем С-пептид-маркировки. Добавление в культуру факторов дифференцировки: активина А, никотинамида и Еx-4, привело к увеличению количества инсулин-позитивных клеток до 2,73% от общей популяции, по сравнению с контрольной культурой, где количество инсулин-позитивных клеток увеличилось за тот же период менее чем на 1%.

В настоящее время ЭСК не применяются в регенерационной терапии СД I типа в связи с проблемами, возникающими при их трансплантации: с тератогенностью ЭСК, необходимостью использования иммуносупрессии, но главное - с нерешенностью этических и правовых проблем получения и использования ЭСК в клинике.

Получение in vitro инсулин-продуцирующих клеток - производных прогениторных/стволовых клеток ПЖ

На сегодняшний день существует множество прямых и непрямых доказательств существования прогениторных/стволовых клеток в области протоков и ОК ПЖ взрослого человека.

Известно, что во время эмбриогенеза ОЛ развиваются из прогениторных/стволовых клеток, ассоциированных с дуктальным эпителием ПЖ. Следуя этой гипотезе, исследовательская группа V. Ramiya et al. (2000) впервые обнаружила в культуре эпителиальных клеток протоков ПЖ NOD/Uf мышей полипотентные прогениторные/стволовые клетки, которые в процессе длительного культивирования образовывали островковоподобные кластеры, характеризующиеся экспрессией глюкагона, инсулина и содержащие a-, b-, d-клетки [97]. Последующая трансплантация полученных функциональных ОК диабетическим NOD мышам приводила к длительному снижению у них гипергликемии и регрессу СД I типа. Несмотря на это, уровень экспрессии инсулина в опытных ОК был очень низким.

В ряде работ [98, 99] неогенез ОК также был показан в культуре ткани протоков, выделенных из ПЖ человека. Данный метод основан на культивировании остаточной фракции смешанных клеток ПЖ, полученной после выделения ОК. На первом этапе клетки наращивали в культуре, что приводило к формированию клеточного монослоя, содержащего большей частью цитокератин (СК)-19-позитивные эпителиальные клетки протоков, а также некоторое количество мезенхимоподобных и эндокринных клеток ПЖ. В дальнейшем полученную клеточную культуру подвергали дифференцировке путем нанесения на ее поверхность тонкого слоя внеклеточного матрикса (Matrigel) и добавления бессывороточной среды с никотинамидом. Такое сочетание условий приводило к формированию островково-подобных трехмерных кластеров, от которых «отпочковывались» ОК. Культивированные человеческие островковые «почки» (the cultivated human islet buds - СHIBs) содержали преимущественно инсулин- и глюкагон-позитивные эндокринные клетки, а также СK-19-позитивные эпителиальные клетки. Несмотря на то, что уровень экспрессии гена инсулина в СHIBs составлял около 5% (по сравнению с нормальными ОК ПЖ), они были способны секретировать инсулин в зависимости от уровня глюкозы в культуре. Помимо этого СHIBs обладали ограниченным репликативным потенциалом.

В экспериментальных исследованиях in vivo показано, что комбинированное применение ЕGF и гастрина стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток протоков и их дифференцировку в ОК [100]. Показано, что добавление данной комбинации гормона и фактора роста в культуру ОК человека, частично содержащую клетки экзокринных протоков, приводит к увеличению числа b-клеток в культуре [52]. Анализ клеточной популяции и ее пролиферации в данном эксперименте подтвердил, что увеличение числа инсулин-продуцирующих клеток в культуре возникало в результате дифференцировки клеток протоков чаще, чем путем репликации существующих b-клеток. Показано, что механизм эндокринной дифференцировки также может быть активирован in vitro в клетках протоков ПЖ человека путем эктопической экспрессии нейрогенина-3 (Ngn-3) - одного из главных транскрипционных факторов развития эндокринной части ПЖ [101].

В настоящее время исследования, касающиеся культивирования клеток экзокринных протоков ПЖ человека с целью получения функциональных b-клеток и ОК, затруднены в связи с тем, что имеется множество вопросов, требующих предварительного решения. Так, например, неизвестно, существуют ли в ткани экзокринных протоков ПЖ взрослого человека истинные прогениторные/стволовые клетки, способные дифференцироваться в эндокринные клетки и способны ли эпителиальные клетки протоков утрачивать свой фенотип и трансформироваться в b-клетки ОЛ? Специфические маркеры, по которым возможно идентифицировать прогениторные/стволовые клетки ПЖ, пока не установлены. По мнению R. Gao et al. (2003), в качестве возможных прогениторных/стволовых клеток ПЖ могут выступать СK-19-позитивные эпителиальные клетки экзокринных протоков, а использование бессывороточной среды, никотинамида и внеклеточного матрикса должно быть обязательным компонентом при культивировании клеток для их дальнейшей дифференцировки [99]. В другом исследовании А. Suzuki et al. (2004), используя методы проточной цитометрии и клонального анализа, показали, что возможные кандидаты на роль прогениторных/стволовых клеток ПЖ не несут маркеров гемопоэтических клеток, таких как СD45, TЕR119, c-kit и Flk-1 [102]. Но они имеют специфический маркер c-met - рецептор для фактора роста гепатоцитов (HGF). Тем не менее, идентификация и изоляция прогениторных/стволовых клеток ПЖ остается пока не изученной. Согласно некоторым данным, прогениторные/стволовые клетки ПЖ могут находиться в ОК ПЖ. Согласно ряду экспериментальных работ, в качестве возможных кандидатов могут рассматриваться нестин-позитивные [103], а также малые клетки [104].

Исследовательская группа H. Zulewski et al. (2001) выделили нестин-позитивные клетки из крысиных и человеческих ОК ПЖ, которые могли пролиферировать in vitro и дифференцироваться во множественные клеточные линии, экспрессирующие маркеры клеток экзокринной и эндокринной части ПЖ, а также клеток печени [103]. Согласно мнению авторов, нестин-позитивные мультипотентные прогениторные клетки могут участвовать в процессах неогенеза эндокринных клеток ПЖ. Также показано, что нестин-позитивные клетки-предшественники, выделенные из ПЖ взрослой мыши, способны давать начало линиям клеток ПЖ и нервной ткани [105]. В противоположность данным исследованиям, детально проведенный анализ ранних стадий развития человеческой ПЖ показал, что эндокринные клетки-предшественники не экспрессируют нестин [106]. В ряде экспериментов [107, 108], проведенных на трансгенных мышах с применением генетической конструкции, отслеживающей клеточное происхождение, было показано, что нестин-позитивные прогениторные клетки не участвуют в развитии эндокринных клеток в ОЛ. Известно, что в ПЖ нестин экспрессируется в клетках протоков и ацинусов, в ОК, звездчатых клетках, а также в эндотелии сосудов. С этой точки зрения нестин не является подходящим маркером для прогениторных/стволовых клеток ПЖ. Между тем, вопрос о том, можно ли считать нестин маркером прогениторных/стволовых клеток ПЖ, остается по сей день предметом многих дискуссий.

M. Petropavlovskaya et al. (2002) описали в культуре ОК ПЖ человека и лошадей новый клеточный тип, названный ими «малыми» клетками [104]. Эти клетки обладали способностью формировать малые кластеры и при иммуногистохимическом исследовании позитивно окрашивались антителами на эндокринные гормоны ПЖ и Pdx-1, но были негативными при окраске на СK-19 и нестин. Несмотря на то, что в работе не было указаний на пролиферативный и дифференцировочный потенциал «малых» клеток, скорее всего, их способность к росту и пролиферации недостаточна для необходимой клеточной экспансии in vitro.

В ряде экспериментальных работ в качестве одного из возможных механизмов неогенеза ОК и b-клеток обсуждается пластичность экзокринных и эндокринных клеток ткани ПЖ. Ацинарные клетки не рассматриваются в качестве стволовых/прогениторных клеток ПЖ. Однако, как показано на модели перевязки протоков ПЖ у крыс, ацинарные клетки обладают способностью к дифференцировке в эпителиальные клетки, формирующие дуктально-подобные структуры, из которых впоследствии могут образовываться b-клетки [109]. Исследовательская группа I. Rooman et al. (2000), также наблюдала прямую ацинарно-дуктальную трансдифференцировку in vitro, в результате чего в процессе культивирования ацинарные клетки теряли свой фенотип и начинали экспрессировать СK-7, СK-20, Flk-1, а также Pdx-1 - маркеры эпителиальных клеток протоков ПЖ [110]. Эти данные позволяют предположить, что эпителиальные клетки, полученные в процессе трансдифференцировки ацинарных клеток, могут рассматриваться в качестве возможных прогениторных/стволовых клеток ПЖ. Исследования K. Song et al. (2004) подтвердили эти результаты [111]. Более того, при культивировании ацинарных клеток ПЖ крыс ими были обнаружены инсулин-продуцирующие клетки, коэкспрессирующие СK.

M. Gershengorn et al. (2004) выдвинули концепцию эпителиально-мезенхимальной трансформации в качестве возможного механизма постнатальной регенерации b-клеток в ПЖ человека [112]. Как показано этими авторами, человеческие ОК в процессе их культивирования могут дедифференцироваться путем эпителиально-мезенхимальной трансформации в фибробластоподобные клетки с мезенхимальным фенотипом, которые в процессе экспансии способны к последующей редифференцировке в островковоподобные структуры, представленные эпителиальными клетками, экспрессирующими инсулин.

В настоящее время основным препятствием клинического применения взрослых прогениторных/стволовых клеток ПЖ является малочисленность их популяции в ткани, трудность выделения, а также отсутствие эффективных методов выращивания в культуре в связи с их низким пролиферативным потенциалом.

Трансплантация клеток костного мозга и пуповинной крови

В последние годы появилось большое количество экспериментальных работ, в которых было изучено влияние трансплантации мезенхимальных стволовых/прогениторных клеток костного мозга (КМ) на процессы регенерации b-клеток и ОЛ в ПЖ при СД I типа. В них, в частности, исследовались механизмы регенераторного действия клеток КМ (ККМ): обсуждалась возможность трансдифференцировки мезенхимальных стволовых/прогениторных ККМ в b-клетки ОЛ, а также способность ККМ запускать процессы регенерации b-клеток in vivo за счет стимуляции ангиогенеза и неоваскулогенеза в ПЖ, наряду с продукцией этими клетками регуляторных пептидов (ростовых факторов, цитокинов) - регуляторов морфогенеза органов и тканей.

Так, А. Ianus et al. (2003) на модели аутоиммунного СД у мышей-самок трансплантировали мезенхимальные стволовые/прогениторные ККМ от мышей-самцов (доноров), экспрессирующих GFP (green fluorescent protein), причем GFP-белок экспрессировался в ККМ доноров-самцов только при условии активации в них транскрипции гена инсулина [113]. Используя метод FАСS (fluorescence-activated cells sorter) и цитогенетический метод FISH (fluorescence in situ hybridization), через 4-6 недель после трансплантации донорского КМ авторы обнаружили в ОК мышей-самок (реципиентов) GFP⁺- клетки с Y-позитивной хромосомой, которые составляли 1,7-3% от общего числа эндокринных клеток ПЖ. Кроме того, выявленные в пределах ОК мышей-реципиентов GFP⁺-клетки экспрессировали инсулин, GLUT-2 и ряд других генетических маркеров, характерных для в-клеток ПЖ. В культуральных условиях in vitro изолированные GFP⁺-клетки донорского происхождения секретировали инсулин в ответ на физиологическую стимуляцию глюкозой. Авторы полагали, что в этих опытах ими была доказана способность мезенхимальных стволовых/прогениторных ККМ к трансдифференцировке в b-клетки.

Однако в ряде других исследований [114-116] данные А. Ianus et al. (2003) не были подтверждены. Авторами этих работ было высказано предположение, что стволовые/прогениторные ККМ участвуют в процессах регенерации b-клеток в ПЖ, но не за счет их трансдифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки, а преимущественно путем их слияния (химеризации) с b-клетками поврежденного органа.

В ряде исследований in vitro было показано, что мезенхимальные стромальные клетки (МСК) [117], выделенные согласно их пластик-адгезивным свойствам из КМ или жировой ткани, обладают способностью к трансдифференцировке в инсулин-продуцирующие клетки при культивировании в соответствующих средах [118-120]. Так, L. Сhen et al. (2004), нашли, что полученная культура МСК КМ обладала глюкозо-зависимой секрецией инсулина in vitro, а при ее трансплантации крысам с STZ СД I типа происходило снижение гипергликемии у животных [118]. При этом авторы наблюдали экспрессию нестина на одной из промежуточных стадий дифференцировки ККМ. В другой экспериментальной работе человеческие МСК КМ трансфецировали генами Foxa2, Hb9 и Pdx1, ранними транскрипционными факторами в-клеток, с помощью ретровирусного вектора и кокультивировали с ОК. Такая процедура также способствовала дифференцировке МСК в инсулин-продуцирующие клетки [120]. Несмотря на описанные наблюдения, вопрос о том, является ли трансдифференцировка МСК в функциональные инсулин-продуцирующие клетки нормальным и физиологическим явлением в условиях живого организма, остается дискуссионным, так как к настоящему времени пластичность МСК продемонстрирована лишь в условиях эксперимента. Доказательства возможности слияния клеток разных фенотипов in vivo свидетельствуют против концепции пластичности мезенхимальных стволовых/прогениторных ККМ и ставят под сомнение терапевтическую стратегию применения ККМ, основанную на этой концепции [121].

Известно, что в основе СД I типа лежит глубокая дизрегуляция гуморального и клеточного иммунитета на фоне прогрессирующего аутоиммунного процесса. В условиях наблюдаемого иммунного дисбаланса возникает нарушение информационного межклеточного взаимодействия и угнетение воспринимающей, индукционной и пролиферативной активности прогениторных/стволовых клеток ПЖ, что проявляется торможением миграционной активности и нарушением запуска процессов восстановительной регенерации b-клеток ОЛ.

С этой точки зрения, использование ККМ для коррекции СД I типа и его осложнений является перспективным и обоснованным методом. Улучшение эндокринной функции и увеличение пула b-клеток в ПЖ после внутрисосудистого введения стволовых/прогениторных ККМ ряд авторов связывают с секрецией ими противовоспалительных и иммуномодулирующих цитокинов с антиапоптотическим и ангиогенетическим действием, обладающих адаптивными и регуляторными эффектами на различные функциональные системы, в том числе и на иммунную систему - важнейшую интегративную систему организма. Известно, что стволовые/ прогениторные ККМ, будучи клетками иммунной системы,

секретируют in vitro обширный спектр регуляторных пептидов - цитокинов, хемокинов и факторов роста, с помощью которых регулируется репаративный и физиологический морфогенез органов и тканей [122].

Y. Izumida et al. (2005) показали, что при трансплантации ККМ происходит активация c-met/HGF сигнального пути, что может приводить к регенерации b-клеток в ПЖ [123]. Начиная с 7-х суток после изотрансплантации свежевыделенных мононуклеарных ККМ крысам с STZ СД I типа, было отмечено более чем 8-кратное увеличение содержания HGF в сыворотке крови животных по сравнению с группой контроля на протяжение всего эксперимента. На фоне трансплантации ККМ у диабетических крыс наблюдалось увеличение концентрации инсулина в плазме крови, снижение гипергликемии, а также увеличение числа инсулин- продуцирующих клеток в ПЖ. Используя метод мечения ККМ витальным красителем PKH-26 и последующее иммуногистохимическое исследование криосрезов ПЖ с применением DАPI метода окраски ядер ККМ и антител к HGF, c-met, инсулину, BrdU, Pdx-1, СK-20, было показано, что все новообразованные b-клетки локализовались в области экзокринных протоков ПЖ. Основываясь на полученных результатах, авторы предположили, что ККМ могут играть роль в синтезе эндогенного HGF в организме и способны путем прямого взаимодействия с гепатоцитами и/или паракринного взаимодействия с помощью неизвестных пока факторов повышать секрецию HGF, который способен стимулировать дифференцировку c-met⁺-эпителиальных клеток протоков ПЖ в инсулин-продуцирующие клетки. Известно, что взаимодействие между рецептором c-met и HGF, которое происходит в организме опосредованно путем обмена сигналами между мезенхимальными [124] и эпителиальными клетками, играет важную роль на эмбриональном этапе развития ПЖ [125, 126].

В работе M. Banerjee et al. (2005) была показана прямая зависимость между эффектом от проводимой клеточной терапии и кратностью введения ККМ [127]. Изотрансплантацию клеток свежевыделенного нефракционированного КМ проводили облученным мышам линии Swiss albino с моделью STZ СД I типа путем однократного или многократного (минимум - трехкратно) внутривенного введения в хвостовую вену с регулярным интервалом в 6 дней. Было установлено, что на фоне многократного введения ККМ в течение одного месяца происходило постепенное и достоверное снижение показателей высокого уровня глюкозы в крови до нормогликемии, которая сохранялась в течение всего эксперимента (длительностью до 1 месяца), в отличие от группы животных с однократным введением ККМ, где отмечалось незначительное снижение гипергликемии. Нормализация показателей гликемии у диабетических мышей с многократным введением ККМ была подтверждена положительными результатами при проведении глюкозо-толерантного теста. На гистологических срезах ПЖ этих мышей было обнаружено увеличение количества новообразованных ОК с малым диаметром (менее 50 мкм по сравнению с нормальными ОК), которые локализовались в области протоков и ацинусов ПЖ.

Аналогичные результаты были получены группой R. Lee et al. (2006) [128]. Культивированные в течение 7-9 дней до 70% монослоя человеческие мультипотентные МСК КМ вводились двукратно с интервалом 7 дней в полость левого желудочка иммунодефицитным NOD/scid мышам с моделью STZ СД I типа. Начиная с 14-го дня от момента первого введения МСК, в группе диабетических животных с трансплантацией ККМ происходило достоверное снижение гипергликемии и полиурии, а также повышение уровня мышиного инсулина, при этом человеческий инсулин в образцах крови не определялся. Результаты, полученные под контролем молекулярно-генетического метода - RT PСR, позволили заключить, что около 3% введенных МСК обнаруживаются в ткани ПЖ и 11% - в ткани почек диабетических мышей. На срезах ткани ПЖ мышей с трансплантацией МСК, в отличие от группы диабетического контроля, авторы наблюдали достоверное увеличение количества новообразованных ОК с высокой иммунореактивностью инсулина, которые визуально «отпочковывались» от эпителия протоков ПЖ. На фоне введения МСК в ткани почек мышей с СД I типа было отмечено улучшение морфологии гломерулярного аппарата, уменьшение мезангиального утолщения и инфильтрации ткани макрофагами. При иммуногистохимическом исследовании криосрезов ткани почек было показано, что часть МСК экспрессировали СD31 - (platelet-endothelial cell adhesion molecule-1 (PЕСАM-1)) и имели морфологию эндотелиальных клеток.

Имеются все основания признать, что ККМ участвуют не только в регенерации паренхимы органов, но также в регенерации и новообразовании сосудов. С этими эффектами связывают прежде всего активацию гемангиобластов, которые, как полагают, представляют самостоятельную популяцию ККМ, а также активацию мезенхимальных прогениторных клеток, которые содержатся как во фракции МСК КМ [128], так и во фракции гемопоэтических ККМ [129], и могут дифференцироваться в эндотелиоциты.

У больных СД I типа в условиях повышенного апоптоза клеток, на фоне окислительного стресса и других многочисленных метаболических нарушений, количество циркулирующих в крови предшественников эндотелиальных клеток (ПЭК) резко снижено, что проявляется снижением процессов неоваскуляризации в организме. Дисфункция ПЭК приводит к снижению сосудистого регенеративного потенциала, замедляет регенерацию ОЛ и способствует развитию сосудистых осложнений при СД I типа [130].

Показано, что клетки мононуклеарной фракции КМ могут мигрировать в ткань ПЖ в ответ на ее повреждение и стимулировать неоангиогенез, тем самым запуская процессы регенерации пула b-клеток [129, 131]. Было установлено [129], что при внутривенном введении c-kit (СD117) фракции мононуклеарных ККМ от GFP-трансгенных мышей, иммунодефицитным NOD/scid мышам с моделью STZ СД I типа, происходило снижение гипергликемии и повышение уровня инсулина в крови. На гистологических срезах ткани ПЖ мышей-реципиентов авторы наблюдали пролиферацию и неогенез b-клеток в области протоков и ОК, где также были найдены GFP⁺ - ККМ мышей-доноров, причем 2,5% этих клеток позитивно окрашивались антителами к инсулину, однако не экспрессировали Pdx-1 - маркер b-клеток, что отрицало возможность их трансдифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки. Одновременно было показано, что донорские ККМ при введении в организм мышей-реципиентов способны дифференцироваться в эндотелиальные клетки (ЭК) ПЖ. Процесс дифференцировки в ЭК подтверждался позитивным иммуногистохимическим окрашиванием донорских GFP⁺- ККМ на эндотелиальный белок PЕСАM-1 (СD31). Несмотря на то, что в данной работе не были установлены возможные источники регенерации пула b-клеток в организме диабетических мышей-реципиентов, авторами было высказано предположение, что ККМ способны мигрировать в область поврежденных ОК ПЖ, где они и дифференцируются в ЭК. В свою очередь новообразованные ЭК костномозгового происхождения начинают стимулировать пролиферацию локальных стволовых/прогениторных клеток ПЖ посредством выделения ими трофических факторов или благодаря какому-то другому механизму, индуцирующему дифференцировку в b-клетки ОЛ. Сходный механизм эндотелиально-стимулированной дифференцировки b-клеток выявляется в период эмбрионального развития ПЖ [132].

Аналогичные результаты также были получены группой V. Mathews et al. (2004), которые на модели STZ СД I типа у мышей проводили трансплантацию мононуклеарной фракции сингенного КМ, полученного от GFP-трансгенных доноров [131]. Непосредственно перед трансплантацией ККМ мышам-реципиентам с СД I типа вживляли подкожно микрокапсулы с инсулином для снижения изначально высокого уровня гликемии и последующего поддержания ее на субнормальном уровне. После трансплантации донорские GFP⁺ - ККМ, экспрессирующие СD45⁺ и vWF⁺ (von Willebrand factor), обнаруживали повсеместно в ОК ПЖ мышей-реципиентов. В то время как общее количество донорских GFP⁺ - ККМ постепенно снижалось в ткани ПЖ, количество эндотелиальных клеток собственного и донорского происхождения увеличивалось в зависимости от степени повреждения ОК. Наблюдались признаки неоангиогенеза в ткани ПЖ. В отличие от результатов, полученных D. Hess et al. (2003), авторы в данном исследовании не смогли показать положительное влияние введения ККМ на течение гликемии у мышей-реципиентов с СД I типа, т.к. при удалении микрокапсул с инсулином, показатели глюкозы в крови возвращались на изначально высокий уровень [129]. Возможно, что отсутствие репаративной регенерации в-клеток в данной работе могло быть связанно с изначальной коррекцией высокого уровня гликемии у мышей с СД I типа путем введения в организм экзогенного инсулина (микрокапсул), что в итоге могло привести к подавлению сигналов, направленных на активацию процессов пролиферации и неогенеза инсулин-продуцирующих клеток ПЖ.

Основываясь на данных экспериментальных исследований, несколько групп в разных странах приступили к клиническим испытаниям метода клеточной терапии СД I типа у человека с использованием ККМ. Показано, что системное [133], а также местное (артериальным катетером в чревный ствол) [134] введение аутогенных ККМ приводит к улучшению функции ПЖ, коррекции метаболических нарушений, снижению суточных доз экзогенного инсулина, снижению титра аутоантител к антигенам b-клеток, анти- тел к инсулину, аутоантител к глутаматдекарбоксилазе (GАD), повышению резистентности к сахарной нагрузке, а также увеличению синтеза С-пептида, что косвенно указывает на активацию процессов регенерации b-клеток в ПЖ у больных СД I типа.

Активное изучение и возможность применения стволовых/прогениторных клеток пуповинной крови (ПК) человека в клеточной терапии СД I типа обусловлены тем, что этот источник рассматривается как альтернатива КМ.

Показано [135], что на фоне ксенотрансплантации клеток ПК человека значительно снижалась вероятность и интенсивность развития аутоиммунного инсулина в ОК ПЖ NOD мышей с моделью аутоиммунного СД. Оказалось, что поддержание нормогликемии, выживаемость животных и степень выраженности аутоиммунной агрессии против b-клеток ПЖ находятся в прямой зависимости от дозы вводимых клеток. Так, при введении мышам с СД I типа 200 млн мононуклеарных клеток ПК человека положительные эффекты были выражены более значимо, чем при трансплантации 100 млн клеток.

Полагая, что стволовые/прогениторные клетки ПК способны к миграции в область поврежденных ОК ПЖ и что коррекция аутоиммунных процессов активирует запуск механизмов регенерации b-клеток, были проведены пилотные клинические испытания метода трансплантации аутогенных клеток ПК у 9 пациентов с СД I типа. У этих больных был достигнут положительный результат [136].

Заключение

Анализ современных концепций развития СД I типа показывает, что стойкая инсулиновая недостаточность при СД I типа является результатом неэффективной репаративной регенерации поврежденных ОЛ. Недостаточность репаративных процессов в ОЛ в значительной мере обусловлена и поддерживается глубокими нарушениями функций иммунной системы (аутоиммунный процесс), которая более других интегративных систем организма ответственна за регуляцию морфогенеза и поддержание структурного гомеостаза. Клеточная терапия - ОК ПЖ или ККМ и ПК - позволяет в наиболее полном объеме обеспечить доставку в организм

дефицитных пептидов и факторов межклеточного взаимодействия, которые способствуют активизации репаративных процессов в ОЛ и восстановлению их функции. При трансплантации ОК в большей степени восполняется дефицит тканеспецифических регуляторных пептидов регенерации ОЛ. При трансплантации ККМ и ПК регенерация ОЛ и сосудов достигается через устранение дизрегуляции иммунной системы и восстановление адаптационных функций всех интегративных систем организма, которые повышают резервы регенерации ОЛ (b-клеток, сосудистого русла) и нормализуют собственную инсулин-продуцирующую функцию ПЖ.

About the authors

A. R. Zakiryanov

Research institute of transplantology and artificial organs

Author for correspondence.
Email: logart@mail.ru

The stem cell biotechnology laboratory

Russian Federation, Moscow

N. A. Onishchenko

Research institute of transplantology and artificial organs

Email: logart@mail.ru

The stem cell biotechnology laboratory

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files