Large scale production of differentiated erythrocytes from human hematopoietic stem cells

Full Text

Известно, что гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК) является родоначальницей всех форменных элементов крови. Однако до настоящего времени не удавалось получить полностью зрелые эритроциты из ГСК in vitro и моделировать все стадии эритропоэза. Ранее сообщалось о выделении и характеристике эритроидных предшественников (ЭП) из ГСК [1-3], но не зрелых форм. Для масштабирования клеток крови из ГСК применяют 2-3-х ступенчатые протоколы культивирования. На первом этапе производят экспансию ГСК, кокультивируя их на стромальных линиях или первичных стромальных клетках костного мозга, создавая тем самым комфортное микроокружение и искусственную нишу. В последнее время исследователи добиваются высокой экспансии и хорошей дифференцировки в условиях бесстромального культивирования, что, с одной стороны, упрощает протокол, а с другой - требует добавления в культуру дополнительных цитокинов. Этап экспансии требует добавления в культуру цитокинов и факторов роста, стимулирующих пролиферацию ГСК (SCF, IL-6, IL-3, TPO, flt3- ligand) без «ухода» в лимфоидную или миелоидную дифференцировку. Задача следующих этапов - стимуляция специфической дифференцировки в «стромальных или беcстромальных» условиях культивирования. В 2002 году был опубликован первый протокол по крупномасштабному выделению ЭП человека [4]. Группе Neildez-Nguyen удалось добиться более чем 200000-кратной экспансии ГСК пуповинной крови (CD34+) и выделения ЭП из них с чистотой 95-99%. Однако клетки становились полностью зрелыми только in vivo, в течение первых 4-х дней после инъекции в NOD/SCID мышей [4]. Новый протокол французской группы, опубликованный в Nature Biotechnology, позволяет добиться крупномасштабного выделения полностью зрелых эритроцитов человека из ГСК in vitro. CD34+ клетки выделяли из костного мозга, периферической крови (нормальной и мобилизированной G-SCF) здоровых волонтёров и пуповинной крови, методом магнитного сортинга (miniMACS). Очищенные клетки культивировали в бессывороточных условиях. Производили трехступенчатую экспансию. Первые дни ГСК культивировали в присутствии цитокинов (IL-3, SCF, EPO), стимулирующих преимущественно пролиферацию. Затем масштабированные клетки разводили в большом объёме среды и культивировали на стромальной мышиной линии MS-5 или в присутствии первичных стромальных клеток костного мозга человека и EPO (эритропоэтина). В заключительной стадии все цитокины отменяли, оставляя «клетки на строме» в течение 10 дней. При этом количество клеток увеличивалось в 16 500 раз для ГСК костного мозга и периферической крови, в 29 000 - для мобилизированной крови и в 140 000 для клеток пуповинной крови. Так, например, из 1 миллиона CD34+ клеток, выделенных их мобилизированной крови, получали 30 миллиардов безъядерных эритроцитов. На 8-й день культивирования 95-98% клеток характеризовались как эритробласты. Количество безъядерных клеток возрастало с 1-5% на 11 день культивирования до 65-80% - на 15-й день (98% из них были ретикулоцитами). Дифференцировка ретикулоцитов в зрелые эритроциты наблюдалась с 15-го по 18-й день культивирования. На конечном этапе чистота зрелых эритроцитов в культуре составила 90-100%. Дифференцировку в ЭП подтверждали исследованием характерных колоний - BFU-E (burst forming unit-erythroid) и CFU-E (colony forming unit-erythroid). Интересно, что способность к экспансии ГСК и ЭП сохранялась и в бесстромальных условиях культивирования, однако при этом утрачивалась финальное «созревание» ретикулоцитов в зрелые формы. Общее время культивирования составляло 18 дней, за которое расходовалось 10 литров среды. В предложенной системе был показан процесс нормального синтеза гемоглобина. Так, 95% эритроцитов, выделенных из ГСК костного мозга и периферической крови, содержали HbA и около половины из них - HbF. 64% эритроцитов, выделенных из ГСК пуповинной крови, содержали фетальный гемоглобин (HbF). Другим признаком функциоирования полученных клеток была активность ферментов - фосфат-дегидрогеназы (G6PD) и пируват-киназы (PK). Тест на способность фиксировать и освобождать кислород подтвердил полную функциональную зрелость полученных клеток. Показатели «кислородных» тестов были очень близки к контрольным пробам - эритроцитам, взятым от тех же доноров. Для подтверждения способности к дифференцировке in vivo, NOD/SCID мышам интраперитонеально вводили меченые ретикулоциты, порлученные in vitro. Через 3 дня наблюдали большинство (>90%) меченых клеток в периферическом кровотоке, подтверждая их происхождение от человека. Получение полностью зрелых эритроцитов in vitro позволит изучить эритропоэз в норме и патологии. Предложенный способ масштабирования эритроцитов in vitro впервые открывает в медицине возможность аутогемотрансфузий аутогенных доз эритромассы. Так, одна стандартная доза донорских эритроцитов содержит 2Ч10¹² клеток. Из одного образца пуповинной крови можно выделить 2-5 млн CD34+ клеток, а из мобилизированной крови ~ 5 млн/ кг веса. При показанной исследователями степени экспансии можно получить как минимум 1 полноценную дозу эритромассы. То есть, предложенный протокол вполне совместим с клиническими требованиями по количеству эритроцитов для трансфузий. Подобные аутогемотрансфузии могут быть полезны при различных формах анемий и хронических кровопотерях, но не в острых ситуациях. Так, при серповидно-клеточной анемии можно искусственно повысить количество незрелых форм, богатых HbF, что возможно, приведёт к коррекции полимеризации гемоглобина и терапевтическому эффекту. Аутоэритроцитарная трансфузия позволит поддерживать срок жизни введённых клеток до 120 суток, в то время как донорские эритроциты способны жить в реципиенте только 28 дней. Теоретически, метод способен совершить революцию в медицине, несмотря на высокую стоимость и стать уникальным. При этом следует помнить о высоком риске инфицирования и о гарантиях безопасной (по HIV, HCV, HBV и т.д.) трансфузии эритроцитов.

Рис. Различные стадии дифференцировки эритроцитов в культуре, а - CD34+ клетки (сразу после выделения), б - эритробласты (8 суток), в - ретикулоциты (15 суток), г - зрелые эритроциты (18 суток). Окраска по Мэй-Грюнвальд-Гимза. Ув. Ч 500. Из Nat Biotechnol (Advanced Online Publication - Published 26, December 2004; doi:10.1038/nbt1047) с изменениями.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. Different stages of erythrocyte differentiation in culture, a - CD34+ cells (immediately after isolation), b - erythroblasts (8 days), c - reticulocytes (15 days), d - mature erythrocytes (18 days). May-Grunwald-Giemsa staining. SW. Ch 500. From Nat Biotechnol (Advanced Online Publication - Published 26, December 2004; doi:10.1038/nbt1047) with modifications.

Download (43KB)

Indexing metadata