Xenogenic contamination of human embryonic stem cell lines

Full Text

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) традиционно культивируются на так называемом фидерном слое (ФС), который поддерживает их выживание в «стволовом» состоянии за счёт секреции в культуру ростовых факторов и блокирует прямой контакт с подложкой, адгезия с которой служит сигналом к началу синтеза белков цитоскелета и спонтанной дифференцировке. В качестве фидерного слоя клеток обычно используются эмбриональные фибробласты мыши, обработанные антимитогеном - митомицином С. Отработка техники выделения, культивирования и направленной дифференцировки ЭСК во множество различных типов зрелых клеток и тканей, открыло перспективы использования этих клеток в регенеративной медицине. После первого получения линии ЭСК человека в 1998 году [1], в последующие 3 года различными академическими институтами и частными компаниями было создано ещё более 20 бессмертных линий, зарегистрированных в регистре NIH [2]. В августе 2001 президент США запретил создавать новые линии ЭСК на территории страны с исследовательской и терапевтической целью по этическим соображениям. Все линии, зарегистрированные до этой даты, могли быть использованы только с исследовательской целью [2]. В февральском номере Nature Medicine группой исследователей под руководством Varki A. из University of California было показано, что линии ЭСК человека, созданные до 2001 в США содержат ксеноантиген - сиаловую кислоту, интегрировавшуюся из мышиного ФС и среды культивирования, содержащую заменитель сыворотки с ксенобелками. Работа вызвала немало шума, показав потенциальную непригодность этих линий для получения клеток с целью трансплантации их человеку, в связи с высоким риском иммунного ответа на них. В клетках человека, в отличие от других млекопитающих, не синтезируется сиаловая кислота - N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc), однако имеется её метаболический предшественник - N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac).

Для проверки гипотезы возможности интеграции Neu5Gc в человеческие ЭСК в стандартных условиях культивирования исследователи тестировали линию H1 (WiCell Research Institute) [3] на содержание этого ксеноантигена в мембране и цитоплазме. ЭСК культивировали в стандартных условиях мышиного ФС и заменителя сыворотки (20% KnockOut serum replacement, Gibco), что могло явиться потенциальным источником ксеноконтаминации. Для идентификации Neu5Gc использовали антитела и метод проточной цитометрии. Чтобы отличить ЭСК от фибробластов фидера при анализе, в клетки трансфецировали конструкцию, несущую метку GFP. Количественное содержание Neu5Gc в мембране и цитоплазме ЭСК измеряли методом масс-спектрометрии. Оказалось, что ЭСК содержали Neu5Gc в соотношении: 6-10,5% (от общей концентрации Neu5Gc в культуре) - в мембране, 2,5-9% в цитоплазме. Содержание Neu5Gc в эмбриоидных тельцах составляло 517% в мембране и 6.5-11 в цитоплазме. При установлении источника контаминации выяснилось, что 20% Neu5Gc содержится в мышином ФС и 54% - в самой среде, а именно - в заменителе сыворотки, содержащей ксенопротеины. Таким образом, ксеногенный фидер и добавки в культуру являются источником Neu5Gc, интегрированной в мембрану и цитоплазму ЭСК. В нормальном организме человека имеется различный уровень циркулирующих антител к Neu5Gc. Инкубация H1 линии ЭСК в условиях, содержащих донорскую человеческую сыворотку с высоким титром анти-Neu5Gc-антител (культура 1), приводила к быстрому иммунному ответу, опосредованному IgG-связыванием ксено-Neu5Gc. Напротив, при инкубации в сыворотке с низким титром анти-Neu5Gc-антител (культура 2), уровень IgG был сравним с контрольным (ЭСК, без инкубации в донорской сыворотке). Обычно такая иммунная реакция на поверхности клетки в условиях организма заканчивается комплемент-опосредованным киллингом или фагоцитозом. 37% ЭСК культуры 1 экспрессировали C3b (молекула комплемента), против 22% клеток в культуре 2. При тестировании цитотоксичности in vitro оказалось, что культура 1 вызывает 60-70% гибель и лизис ЭСК в течение 2 часов. Таким образом, введение в организм человека клеток, выделенных из линий ЭСК (созданных в ксеногенных условиях), может привести к выраженному иммунному ответу и их быстрому лизису. Культивированиие ЭСК в человеческой сыворотке (инактивированной нагреванием) (ИСЧ), вместо использования коммерческого заменителя (Gibco), приводило к снижению количества Neu5Gc в мембране клеток ~ в 11 раз через 3 дня культивирования и ~ в 30 раз - через неделю культивирования. Обратная замена продукта сыворотки приводила к противоположному эффекту. При замене культуры 1 (неинактивированная донорская сыворотка человека с высоким титром анти-Neu5Gc-антител) на нормальную ИСЧ с последующим ведением в течение 5-ти дней, происходило снижение концентрации C3b+ (комплемент) ЭСК с 37% до 13%. При тестировании цитотоксичности в условиях ИСЧ процент лизиса оставался довольно высоким - 40%. При снятии ФС и культивировании в условиях ИСЧ ЭСК полностью сохраняли способность формировать эмбриоидные тельца.

Таким образом, исследователями было показано, что простая замена ксеногенных компонентов среды культивирования на ИСЧ приводит к значительному снижению инкорпорации Neu5Gc в ЭСК что, возможно, не будет вызывать иммунного ответа в организме при введении дериватов таких клеток. Идея о возможной контаминации линий ЭСК, культивированных в ксеногенных условиях, далеко не нова и давно требовала проверки. То, что группа Varki смогла это оригинально доказать на примере сиаловой кислоты (Neu5Gc), безусловно является заслугой исследователей перед научным миром. Сообщение было опубликовано в Nature Medicine как технический доклад, то есть именно метод, применяемый в работе оригинален и прост. Можно ли этот метод экстраполировать на прочие культуры клеток, предполагаемые для трансплантации человеку, покажет время. Кроме того, авторы исследования озабочены и тем фактом, что Neu5Gc может встраиваться в мембранные рецепторы ЭСК, которые служат их важными маркёрами - SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81. Такая инкорпорация и замена Neu5Ac может привести к модификации биологических свойств ЭСК и непредсказуемому изменению поведения клеток в культуре [4]. Большинство линий ЭСК, выделенных до 2002 года во всём мире, потенциально содержат подобный ксеноантиген, поскольку создавались в стандартных условиях культивирования [5]. Однако в последние 2-3 года рядом исследовательских групп и частными компаниями были предложены бессывороточные и бесфидерные протоколы культивирования ЭСК. Одна из исследуемых безфидерных систем предполагает использование коммерческого аналога компонентов экстрацеллюлярного матрикса - Matrigel [6, 9, 10]. Владелец нескольких зарегистрированных линий ЭСК - корпорация Geron [7] - одна из первых опубликовала 2 года назад на своём веб-сайте бесфидерный протокол на основе Matrigel [8]. Другие исследователи предлагают не отказываться от ФС, а заменить его на человеческий [11, 12]. В качестве источников последнего предлагаются стромальные клетки костного мозга [13], кожные фибробласты [14], адгезивные клетки плаценты [15]. Подобные подходы уже находят применение при культивировании других клеток - потенциальных кандидатов для клеточной терапии. Например, культивирование стромальных клеток костного мозга (СККМ) для целей клеточной терапии в аутологичной сыворотке пациента [16]; использование фидера из СККМ [17] и бессывороточного протокола для экспансии гемопоэтических клеток [18]. Все эти данные указывают на то, что эра культивирования клеток человека для клинических целей в «ксеногенных» (содержащих ксеносыворотку и ФС) условиях заканчивается. Все новые линии ЭСК должны быть созданы в условиях, свободных от источников ксеногенной контаминации.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files