Study of spontaneous oncogenetic transformation of human mesenchymal stem cells in culture

Full Text

Мезенхимальные стволовые (стромальные стволовые) клетки (МСК) человека считаются одним из самых перспективных видов аутологичного материала для клеточной терапии и тканевой инженерии. МСК были выделены из различных тканей взрослого человека, эмбриона и новорожденного и характеризуются рядом общих свойств, среди которых: высокая способность к пролиферации и адгезии, фибробласт-подобная морфология и образование колоний в культуре, легко-индуцируемая дифференцировка в остео-, хондро-, мио- и адипогенном направлениях. Однозначного мнения по экспрессии маркёров не существует, не описаны и уникальные маркёры МСК. Однако большинство исследователей описывает эти клетки как SH- 2, SH-3, SH-4, STRO-1, Sca-1, Thy-1, CD44, CD29, CD71, CD106, CD120a, CD124 - позитивные и CD34, CD45 - негативные. В биологии МСК ещё очень много вопросов, ответы на которые будут найдены годами кропотливых фундаментальных исследований. Однако уже сегодня начались клинические испытания по введению этих клеток с целью коррекции той или иной патологии. Вопрос об онкогенной безопасности взрослых стволовых клеток вообще и МСК в частности остаётся неизученным, но крайне актуальным, важным и определяющим будущее регенеративной медицины. Известно, что старение клетки сопряжено с укорочением теломер (потерей активности теломеразы) и остановкой клеточного цикла [1]. При культивировании клеток, в определённый момент неизбежно наступает «кризис» (остановка) клеточного цикла (фаза M1) [2]. Феномен спонтанного обхода «кризиса» остановки клеточного цикла и укорочения хромосом был установлен для человеческих клеток недавно [3]. Варианты «обхода» этого неизбежного процесса связаны с приобретением иммортальности при укороченных теломерах, возникновением хромосомных аберраций и канцерогенезом. В конечном итоге, накопление хромосомных мутаций приводит к неизбежному апоптозу (фаза M2) [2]. Логично было бы предположить существование такого феномена и для взрослых стволовых клеток, способных давать более 20-30 удвоений и поддерживаться в культуре до года.

Свойство иммортальности прямо связано с длиной теломер и характерно для эмбриональных стволовых и раковых клеток. Уровень теломеразы МСК человека, по мнению некоторых авторов, неопределим [4]. Было показано, что при размножении человеческих МСК in vitro наблюдается укорочение теломер [5], что может быть связано с обходом фазы M1. Однако имеется указание, что активность теломеразы у МСК, выделенных из жировой ткани, зачительно выше, чем у МСК костного мозга [6]. Для продления жизни МСК в культуре и их экспансии, предпринимались многочисленные попытки трансфекции различными «теломеразными» ген-конструкциями (наиболее популярна hTERT). Иммортализованные МСК не меняли кариотип, фенотип и способность к дифференцировке в течение 2-3 лет [7, 8]. Но недавние исследования показывают, что иммортализация нормальных клеток человека теломеразными конструкциями, считавшаяся до этого безопасной, несёт в себе канцерогенный риск [9]. В исследовании Serakinci N. с соавт. МСК «заставляли» делиться (под действием hTERT) 256 раз и получали при этом опухоли у 100% мышей-реципиентов, а при введении линии МСК с количеством делений 95 не наблюдали развития опухолей. Интересно, что эта разница наблюдалась при неизменном нормальном кариотипе обеих линий [10].

Рис. Изменение морфологии МСК в процессе культивирования, а - МСК в норме; б - «кризис» МСК при культивировании; в - туморогенные МСК. Из Cancer Res 2005; 65: 3035-3039, с изменениями.

Не связана ли высокая способность МСК к пролиферации с накоплением мутаций и онкогенным риском? Может ли онкогенная трансформация МСК происходить спонтанно? Ответы на эти вопросы можно найти в результатах недавнего исследования группы Rubio-Bernad, опубликованном в журнале Cancer Research. Исследователи выделяли МСК человека из биоптатов жировой ткани (взрослых и детей) по общепринятому методу Zuk. Клетки имели типичную фибробласт-подобную морфологию, экспрессировали CD13, CD90, CD105 и CD106, индуцировано дифференцировались в остео- и адипогенном направлениях. Затем клеткам давали спонтанно пролиферировать, поддерживая их стабильный фенотип и морфологию частым пассированием. Способность к образованию опухолей in vivo изучали на иммунодефицитных облучённых мышах. Все свежевыделенные МСК имели нормальный кариотип и не давали роста опухолей при внутривенном введении мышам. В течение 2-х месяцев культивирования часть клеток демонстрировала признаки старения с остановкой клеточного цикла (пре-M1), сохраняя при этом нормальный кариотип. Характерным положительным тестом на «клеточный кризис» служила окраска beta-galactosidase (pH=6). Большая часть клеток, «пережившая кризис», спонтанно (пост-М1) продолжала поддерживаться в культуре до фазы М2. 30% пост-М1 клеток имели трисомию по 8 хромосоме. Следует отметить, что при трансплантации пост-М1 клеток иммунодефицитным мышам не было обнаружено никаких признаков туморогенеза (время наблюдения — 3 мес.). В половине случаев пост-М1 клетки, характеризовались ускорением клеточного цикла, высокой пролиферативной активностью и поддерживались в культуре до полугода. Эти клетки теряли экспрессию CD90 и CD105 и изменяли строение веретена деления и свою морфологию. При кариоти- пировании было выявлено, что большинство из них имело трисомии, тетраплоидии и прочие мутации. Эти клетки условно были названы туморогенные мезенхимальные (ТМСК). Через 4-6 недель после внутривенной трансплантации ТМСК иммунодефицитным мышам наблюдали развитие множественных опухолей почти во всех органах у всех (n=38) животных. Идентификацией меток было подтверждено, что все опухоли происходят из человеческих клеток. Клетки, выделенные из этих опухолей, демонстрировали сходные множественные мутации, те же, что и родительские ТМСК. Было показано, что развитие ТМСК с обходом фаз М1 и М2, ассоциировано с высокими уровнями экспрессии теломеразы, онкогена c-myc и ангиогенного фактора VEGF. Аналогичные результаты были получены в экспериментах с МСК, выделенными из 2-х различных линий мышей (C57BL/6 и CD1). Это говорит о том, что феномен «спонтанной иммортализации и онкогенности» взрослых МСК, впервые описанный авторами в этой работе, имеет большое общебиологическое значение. Высокая частота (50% образцов) спонтанной трансформации нормальных клеток в культуре, также была впервые описана авторами для человека. Интересно, что МСК всех исследованных образцов миновали М1 фазу. Способность онкогеннной трансформации МСК человека, выделенных из жировой ткани, была показана ранее под влиянием генетической конструкции hTERT [10], однако это происходило не спонтанно. До сих пор нет данных о возможной онкогенной трансформации (спонтанной или под влиянием теломеразной конструкции) МСК костного мозга.

Таким образом, авторы впервые показали, что клетки человека способны к спонтанной онкогенной трансформации в культуре без участия факторов роста. Работа приобретает особое значение в контексте потенциального клинического применения мезенхимальных стволовых клеток для клеточной терапии и тканевой инженерии. Можно сделать вывод, что длительное культивирование МСК (в данной работе — более 2 месяцев) ассоциировано с высоким онкогенным риском. По-видимому, все культуры МСК, применяемые в клинике, должны быть как минимум кариотипированы на предмет исключения хромосомных мутаций. Кроме того, можно предположить, что все протоколы по иммортализации МСК теломеразными конструкциями не имеют клинического будущего в связи с высоким онкогенным риском.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure. Changes in the morphology of MSCs during cultivation, a - normal MSCs; b - "crisis" of MSCs during cultivation; c - tumorigenic MSCs. From Cancer Res 2005; 65:3035-3039, as amended.

Download (21KB)

Indexing metadata