Isolation and characterization of neural stem cells from the olfactory region of the mammalian nasal mucosa

Full Text

Мультипотентные стволовые клетки взрослого организма за последние годы были выделены из разных тканей и органов. Однако степень пластичности стволовых клеток дефинитивных тканей в настоящее время активно дискутируется. Так, например, было показано, что нейральные стволовые клетки мыши могут дифференцироваться в гемопоэтические и восстанавливать гемопоэз in vivo [1]. Этот результат был воспроизведён ещё одной группой исследователей [2], однако опровергнут другой [3]. Нейральные стволовые клетки были выделены из разных отделов нервной системы человека, включая и обонятельную область слизистой оболочки носа. 4 года назад Roistein F.J. с соавт. впервые выделил нейральные стволовые клетки из обонятельной области слизистой оболочки носа (ОСН) взрослого человека [4], а позже, Zhang получил аналогичные нейросферы в своей лаборатории [5]. Отдельную субпопуляцию, в обонятельной части слизистой оболочки носа человека образуют так называемые обкладочные нейроэпителиальные клетки (olfactory ensheathing cells), обладающие свойствами нейральных стволовых [6]. Имеются также указания, что клетки базального слоя «обонятельного эпителия» мыши могут дифференцироваться и в экстранейрональном направлении [7, 8].

Исследование австралийской группы Murrell, опубликованное в онлайн-версии журнала Developmental Dynamics, демонстрирует, что нейральные стволовые клетки, выделенные по схожему протоколу из ОСН человека, крысы и мыши обладают мультипотентностью.

Клетки человека выделяли из биоптатов ОСН (полученных после операций септопластики и турбинэктомии) ферментативно-механическим методом. Через 7-10 дней после первичного плэтинга неприкрепившиеся клетки образовывали шаровидные колонии, содержащие около 1000 клеток. Способность к образованию сфер не зависела от возраста донора. Клетки сфер экспрессировали нестин и нейрональные маркёры, характерные для глии (GFAP, O4, GalC) и нейронов (beta-tubulin III, MAP5), то есть являлись нейросферами. Способность к образованию вторичных и третичных сфер сохранялась после диссоциации первичных нейросфер или их криоконсервирования, что указывало на наличие клеток, обладающих свойством самообновления. Было показано, что клетки нейросфер способны к клональному росту без изменения экспрессии маркёров. Степень экспрессии тех или иных нейромаркёров зависела от присутствия различных факторов дифференцировки (NGF, CNTF, ретиноевой кислоты, сыворотки). Способность к дифференцировке изучали в Transwell системе, представляющей из себя кокультуру нейросфер и дифференцированных клеток различных специализированных тканей (мышечных, гепатоцитов) новорожденных крысят, разделённую полупроницаемой мембраной и исключающей прямой межклеточный контакт. При этом клетки нейросфер изменяли свою морфологию и начинали экспрессировать тканеспецифичные маркёры, в зависимости от вида специализированной ткани в кокультуре. Так, при стимуляции дифференцировки клеток сфер гепатоцитами наблюдали экспрессию ими альбумина и ферритина. Кардиомиоцитами - альфа-актина и сердечного тропонина I. Скелетной мышечной тканью - миозин, тропомиозин.

Рис. Образование нейросфер из клеток, выделенных из обонятельной области слизистой оболочки носа человека, 10 дней культивирования. Из Dev Dyn 2005 Epub Mar 21, с изменениями.

Таким образом, способность клеток нейросфер к дифференцировке in vitro зависела от наличия в культуральной среде специфических растворимых факторов, выделяемых клетками специализированных тканей. При трансплантации меченых клеток нейросфер в гаструлу куриного эмбриона, наблюдали их включение во многие ткани. Однако дифференцировка донорских клеток (человека) была показана только для сердца и головного мозга. В аналогичном эксперименте был показан энграфтинг клеток «обонятельного эпителия» мыши во множество органов и тканей куриного эмбриона. Показана трансдифференцировка клеток в нервную, мышечную ткани и гепатоциты. В контрольных экспериментах (введение в гаструлу неклеточной суспензии и трансплантация клеток крови без эритроцитов) не было получено доказательств множественного энграфтинга и дифференцировки in vivo.

Таким образом, было показано, что клетки нейросфер человека и мыши способны дифференцироваться in vivo в ткани всех трёх зародышевых листков. В подтверждение достоверности экспериментов Bjornson C.R. (1999), исследователи выполняли внутривенную сингенную трансгендерную трансплантацию клеток нейросфер (выделенных из ОСН) в организм летально облучённых крыс. Перед трансплантацией все донорские клетки были негативны по CD45 (общий маркёр лейкоцитов) и CD34 (маркёр гемопоэтических клеток). Однако менее 1% клеток трансплантата экспрессировали миелоидный маркёр CD11b, что могло указывать на потенциальную контаминацию клетками крови. Через 9 месяцев степень химеризма реципиента донорскими лейкоцитами составляла 5-20% среди всех выживших животных.

Донорские клетки в крови и селезёнке реципиента коэкспрессировали маркёры Т- , B-, дендритных, миелоидных и гемопоэтических клеток. Тем не менее, вероятность существования и пролиферации CD11 b-клеток, контаминировавших трансплантат, была ничтожно мала. Таким образом, результаты этих экспериментов подтвердили, что клетки нейросфер ОСН крысы обладают способностью к восстановлению гемопоэза и дифференцировке в клетки крови. Вероятность слияния, как возможного механизма «псевдодифференцировки», была также отвергнута рядом экспериментов. При кокультивировании меченых клеток нейросфер и костного мозга мыши, нейросфер мыши и суспензии клеток гаструлы куриного эмбриона не было выявлено ни одного факта слияния. Слияние клеток человека после трансплантации в куриную гаструлу было также исключено анализом ДНК и ядер. Таким образом, в работе было доказано, что в ОСН человека (а также крысы и мыши) существуют мультипотентные стволовые клетки. Остаётся неясной природа этих клеток. Хотя их и можно считать нейрональными стволовыми, поскольку они образуют нейросферы в культуре с экспрессией нестина и маркёров всех типов нервных клеток. Однако, это могут быть как клетки обонятельного нейроэпителия (olfactory ensheathing cells и нейроклетки, выделенные Roisen F.J. и Zhang X. [4, 5]), так и базальные клетки ОСН [7, 8]. Незначительная контаминация CD11b+ клетками (менее 1%) может быть объяснена миграцией в ОСН дендритных клеток и макрофагов, однако не отрицает факта дифференцировки. Отсутствие гемопоэтических клеток в трансплантате и неспособность клеток костного мозга образовывать сферы при культивировании в аналогичных условиях культуры (с нейросферами из ОСН) указывает на «чистоту» эксперимента и значительно снижает вероятность артефактов. Исследователи выделили

клетки с одинаковым потенциалом пластичности из 2-х гистологических структур — «обонятельного эпителия» и соединительнотканной собственной пластинки (lamina propria). «Производительность» метода составила 500-2000 сфер (около 1000 клеток в каждой) из одного биоптата в течение 7-10 дней.

Таким образом, предложен новый альтернативный аутологичный материал для регенеративной медицины. Кроме того, в настоящее время хорошо отработана техника забора такого материала без потери функции обоняния.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure. Formation of neurospheres from cells isolated from the olfactory region of the human nasal mucosa, 10 days of cultivation. From Dev Dyn 2005 Epub Mar 21, with changes.

Download (43KB)

Indexing metadata