Participation of Ito-cells in histogenesis and regeneration of the liver

Full Text

Устоявшаяся теория развития печени базируется на исследованиях, проведенных в середине XX века. Считается, что предшественники гепатоцитов выселяются в мезенхиму поперечной перегородки из эпителия двенадцатиперстной кишки эмбриона. Из эпителиальных клеток образуются гепатобласты/гепатоциты ихолангиоциты, а из клеток мезенхимы дифференцируются синусоидные клетки [1-3]. На определенных этапах развития часть гепатобластов, расположенных вокруг сосудов, образуют так называемую протоковую пластинку, из клеток которой формируются внутрипеченочные желчные протоки [4]. Существование региональной стволовой клетки печени в настоящее время не вызывает сомнений. Традиционно считается, что она находится среди клеток мельчайших внутрипеченочных желчных протоков - канальцев Геринга, а их непосредственными потомками являются так называемые овальные клетки, обладающие свойствами бипотентности и дающие начало как гепатоцитам, так и холангиоцитам [5]. Однако в последние годы установлена возможность развития гепатоцитов из стволовой кроветворной клетки [6-8], т.е. клетки мезенхимальной, а не энтодермальной природы. В связи с этим возникает вопрос: не могут ли постоянно «прописанные» в печени клетки мезенхимального происхождения быть источником гепатоцитов входе развития и регенерации? Для ответа на этот вопрос было предпринято комплексное иммуногистохимическое исследование, в котором с помощью выявления широкого спектра фенотипических и дифференцировочных маркеров проведен детальный анализ всех этапов гисто- и органогенеза печени человека и закономерностей дифференцировки гепатоцитов. Особое внимание было уделено изучению взаимодействия печени с окружающей ее мезенхимой и сопоставлению фенотипов эпителия передней кишки и гепатоцитов. Также была изучена динамика межклеточных взаимодействий в процессе репаративной регенерации печени больных хроническими гепатитами и крыс после частичной гепатэктомии и повреждения печени нитратом свинца. Выбранные экспериментальные модели отличаются тем, что ни в том, ни в другом случае не было описано появление овальных клеток в ходе регенерации.

Материал и методы

Печень эмбрионов и плодов человека различных сроков гестации [с 4-й по 33-ю неделю пренатального развития] получали в результате легальных медицинских абортов, самопроизвольных выкидышей и индуцированных преждевременных родов по медицинским показаниям [78 образцов]. Также были изучены биоптаты печени больных хроническими гепатитами [156 образцов]. Во всех случаях использования для исследований тканей человека нами было получено информированное добровольное согласие родителей и больных. Регенерация у крысы изучена на двух моделях. Исследования проведены на белых лабораторных беспородных крысах - самцах. Операцию частичной гепатэктомии выполняли по методике Хиггенса и Андерсона [9]. Забой животных под эфирным наркозом и взятие печени производили через 1, 2, 3, 5, 7 сут. после операции. Нитрат свинца вводили внутривенно однократно в хвостовую вену в дозе 100 мкМ/кг веса животного [10]. Забой животных под эфирным наркозом и извлечение печени производили через 24,48, 72, 96, 120 часов после введения нитрата свинца.

Печень человека и крысы фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Иммуногистохимическое окрашивание срезов печени человека и крысы проводили стрептавидин-биотиновым методом [11]с использованием коммерческих моноклональных антител и визуализационных систем фирм DAKO [Дания] и NOVOCASTRA [Великобритания]. В работе использованы антитела к эпителиальным маркерам — цитокератинам 18, 19, эпителиальному мембранному антигену [Epithelial Membrane Antigen, EMA], эпителиальному специфическому антигену [Epithelial Specific Antigen, ESA], специфическому антигену гепатоцитов [Hepatocyte Specific Antigen, HSA], билиарному гликопротеину CD66a; к мезенхимальным маркерам - виментину, десмину, альфа-гладкомышечному актину [a-SMA]; к маркерам стволовых и прогениторных клеток — Bcl-2, C-kit, C-met. Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание эмбриональной и плодной печени человека на десмин/цитокератины 18,19, десмин/HSA и десмин/ВсІ-2.

Результаты и обсуждение

Развитие печени человека начинается с выселения небольшого количества эпителиальных клеток из эпителия передней кишки в мезенхиму поперечной перегородки. Результаты изучения закономерностей экспрессии эпителиальных маркеров выявили различные паттерны их появления и динамики. Так, уже на 4-й неделе развития эпителиальные клетки кишки экспрессируют эпителиальный специфический антиген - ESA. Можно видеть ряды интенсивно окрашенных клеток, тянущихся от двенадцатиперстной кишки в печень. Через неделю уже практически все эпителиальные клетки печени экспрессируют этот белок [рис. 1А]. Позднее, по мере дифференцировки гепатобластов, экспрессия ЕЗА постепенно снижается, смещается к периферии печени и к крупным сосудам, а затем исчезает. В дефинитивной печени данный протеин присутствует только в клетках внутрипеченочных желчных протоков. Таким образом, можно заключить, что экспрессия ESA характерна для гепатобластов и незрелых гепатоцитов. Подтверждением этого является и установленная нами экспрессия ESA в регенерирующей печени человека: мы наблюдали мелкие ESA⁺клетки в зонах некрозов и воспаления [рис. 1Б], что может отражать процесс дифференцировки стволовой клетки печени в гепатоциты. Учитывая, что ESA может экспрессироваться не только клетками энтодермы, но и клетками мезодермального эпителия [12], не исключено, что эта предполагаемая стволовая клетка может быть локализована в синусоидах печени.

 

Рис. 1. Иммуногистохимическое окрашивание на ESA (А, Б), HSA (В), CD66 (Г), ЕМА (Д).

Продукт реакции - красного цвета:

А — ESA в гепатобластах эмбриона 4 недель гестации, х100;

Б — ESA-позитивные клетки в зоне воспаления при хроническом гепатите, х400;

В — HSA в гепатоцитах плода 13,5 недель гестации, х400;

Г — CDSS на билиарных полюсах гепатоцитов плода 13,5 недель гестации, х400;

Д — ЕМА в эпителии кишки эмбриона 4 недель гестации

[в печени [внизу справа) ЕМА отсутствует], х200

 

Изучение динамики экспрессии специфического антигена гепатоцитов и билиарного гликопротеина CD66a позволило установить, что, появляясь на 4-5 неделях гестации, экспрессия этих протеинов нарастает, и к 13-14 неделям они присутствуют во всех гепатоцитах [рис. 1В, Г]. Таким образом, данные белки появляются уже в достаточно дифференцированных гепатоцитах, и их присутствие характеризует зрелый фенотип этих клеток. Появление в регенерирующих гепатоцитах именно этих белков может быть использовано как признак завершения их дифференцировки и показатель функциональной зрелости данных клеток после повреждения печени.

Эпителиальный мембранный антиген экспрессируется в различных эпителиях преимущественно на апикальной поверхности клеток, в зрелой печени он присутствует на апикальной поверхности холангиоцитов [13]. Эпителиальные клетки передней кишки с самых ранних сроков эмбриогенеза экспрессируют этот белок. Однако ни на одном из изученных сроков гестации ЕМА не был выявлен в гепатоцитах человека [рис. 1Д]. Таким образом, с ранних сроков развития основной эпителиальный клеточный тип печени — гепатоциты — имеет фенотипические отличия от энтодермального эпителия.

С другой стороны, мезенхимальные клетки в области закладки печени экспрессируют не только маркеры мезенхимальных клеток виментин и десмин, но и белки цитоскелета эпителиальных клеток — цитокератины 18 и 19. Причем последние в клетках мезенхимы и в синусоидах в момент закладки печени экспрессируются намного интенсивнее, чем в гепатобластах [рис. 2А].

Более того, маркер перисинусоидальных клеток печени [имеющих мезодермальное происхождение] - десмин на 4-7 неделях гестации присутствует не только в перисинусоидальных клетках печени [клетках Ито] и в мезенхимных клетках поперечной перегородки, но и в гепатобластах. Уровень экспрессии десмина в последних — слабый, но отдельные гепатобласты окрашиваются достаточно интенсивно [рис. 2Б]. После седьмой недели гестации экспрессия десмина в мезенхимных и перисинусоидальных клетках человека постепенно снижается и к 12-й неделе прекращается полностью. В дальнейшем десмин в печени человека можно выявить только в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов.

Интереснейшей находкой нашего исследования стало выявление клеток, одновременно экспрессирующих десмин и цитокератины [рис. 2В]. Кроме того, клетки, экспрессирующие десмин, и HSA-позитивные клетки находятся в непосредственной близости друг к другу [рис. 2Г]. Поскольку HSA - белок, который ранее обнаруживался только в фетальных и зрелых гепатоцитах [14, 15], такая картина позволяет предположить, что десмин-позитивные клетки могут дифференцироваться в гепатоциты.

 

Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание на цитокератин 19 (А) и десмин (Б). Продукт реакции - красного цвета.

Двойное иммуногистохимическое окрашивание на десмин (продукт реакции - красного цвета) и цитокератин 19 (В), HSA (Г), ВсІ-2 (Д) - продукт реакции синего цвета: А - цитокератин19 в синусоидных клетках [стрелки] эмбриона 4-5 недель гестации, х400;

Б — десмин в гепатобластах эмбриона 4 недель гестации, х1000;

В — десмин⁺/цитокератин 19⁺ клетки [стрелки] в печени эмбриона 4 недель гестации, х1000;

Г — десмин и HSA в клетках [стрелки] печени эмбриона 6 недель гестации, х1000;

Д — десмин⁺/Вс/2⁺ клетки [стрелки] в печени эмбриона 4 недель гестации, х1000

 

Установленный факт экспрессии клетками мезенхимы и синусоидными клетками печени цитокератинов, а гепатоцитами — десмина в одни и те же сроки гестации указывает на общность этих клеток и возможность трансдифференцировки одного клеточного типа в другой. Похожие результаты были получены нами ранее [16] при изучении пренатального развития печени крысы — на 11-13 дни гестации все клетки железы экспрессируют десмин, затем в цитоплазме большей части десмин⁺ клеток появляются цитокератины 8 и 18, а десмин постепенно исчезает, и клетки становятся типичными гепатобластами. Оставшаяся часть десмин⁺ клеток никуда не исчезает, они остаются в контакте с гепатобластами, а затем с гепатоцитами, и представляют собой десмин⁺ клетки Ито.

Исходя из полученных результатов, можно предположить, что существует альтернативный кишечной энтодерме источник развития гепатобластов, а именно — мезенхима поперечной перегородки. Более того, наличие в гепатобластах и синусоидных клетках маркера перисинусоидальных клеток печени десмина позволяет выделить конкретную популяцию клеток, развивающихся из мезенхимы, а затем дающих начало гепатоцитам. Такой популяцией, очевидно, являются перисинусоидальные клетки. В литературе имеются данные о тесной связи пролиферации овальных клеток, которые, с одной стороны, рассматриваются как потомки стволовых клеток печени [5], а с другой — ничем не отличаются от гепатобластов [17], с пролиферацией перисинусоидальных клеток [18, 19], что указывает на тесную функциональную взаимосвязь между ними. Более того, в последние годы опубликованы работы, прямо или косвенно свидетельствующие о том, что перисинусоидальные клетки могут дифференцироваться в эпителий. Так, установлено [20], что в период печеночного гемопоэза у мышей и у человека стромальные элементы микроокружения, основную массу которых составляют перисинусоидальные клетки, одновременно экспрессируют маркеры мезенхимных и эпителиальных клеток in vitro. Методами двойного иммуногистохимического окрашивания было показано, что покоящиеся перисинусоидальные клетки крысы и человека экспрессируют специфический маркер эпителиальных клеток Е-кадгерин как in vivo, так и in vitro [21]. Также было обнаружено, что перисинусоидальные клетки человека in vitro [22] и перисинусоидальные клетки трески [23] экспрессируют цитокератины. Результаты ранее проведенных нами экспериментов по органотипическому культивированию эмбриональной печени крыс и по культивированию чистой популяции перисинусоидальных клеток, в которых было показано, что in vitro они приобретают фенотип гепатобластов/гепатоцитов, позволили впервые описать мезенхимально-эпителиальную трансформацию перисинусоидальных клеток [24], что еще больше подтверждает наши предположения.

Для выяснения стволовых потенций мезенхимных клеток печени были изучены закономерности экспрессии маркеров стволовых и прогениторных клеток в пренатальном онтогенезе печени человека и в ходе регенерации печени. Результаты изучения экспрессии маркеров прогениторных клеток показали, что почти во всех клетках мезенхимы, окружающей печень, и в большинстве её синусоидных клеток, в том числе и в десмин⁺ [рис. 2Д], происходит экспрессия антиапоптотического протеина Bcl-2 с четвертой до седьмой недели гестации включительно. Этот белок присутствовал также в единичных гепатоцитах. Очевидно, что данный паттерн экспрессии Bcl-2 [являющегося одним из маркеров прогениторных клеток] может свидетельствовать о стволовых потенциях синусоидных клеток печени и клеток окружающей её мезенхимы, в том числе и десмин-позитивных клеток.

C-met является рецептором к фактору роста гепатоцитов [сильному митогену для этих клеток] и рассматривается в качестве одного из маркеров стволовых клеток [25]. В конце четвертой - начале пятой недели внутриутробного развития выявлена слабая экспрессия C-met в гепатобластах, причём немного интенсивнее окрашивались клетки на периферии печени [рис. ЗА], особенно в области мезенхимы поперечной перегородки. На 6-8 неделях гестации экспрессия C-met в гепатоцитах становилась еще более неоднородной: более ярко окрашивались гепатобласты [рис. ЗБ] и свободно лежащие гепатоциты, тогда как в «плотно упакованных» гепатоцитах экспрессия была намного слабее. В центральных отделах печени также были выявлены C-met⁺ клетки. Они были близки по своим морфологическим признакам к гепатоцитам, интенсивность их окрашивания была умеренной.

В эти же сроки [4-9 недель гестации] экспрессия C-met была выявлена в мелких, очевидно, синусоидных, клетках, и в них она была намного более интенсивной, чем в гепатобластах и гепатоцитах. Синусоидные C-met⁺ клетки были локализованы в основном на периферии печени, а в некоторых местах клетки образовывали кластеры [рис. ЗВ]. Такие же клетки внутри печени можно было видеть около сосудов, но они были единичными. C-met⁺ клетки выявлялись в синусоидах печени и в более поздние сроки пренатального развития [как минимум, до 14-й недели гестации].

В ходе регенерации печени человека мы также выявили C-met-позитивные синусоидные клетки в зонах некровоспалительных изменений [рис. ЗГ]. Кроме того, клетки такой же локализации и морфологии экспрессировали ESA [см. рис. 1Б].

 

Рис. 3. Экспрессия C-met в эмбриогенезе (А, Б, В) и при регенерации (Г).

Продукт иммуногистохимической реакции - красного цвета, х400:

А — в гепатобластах эмбриона 4 недель гестации;

Б — в гепатобластах эмбриона 7 недель гестации;

В — видны кластеры клеток в синусоидах и на периферии печени эмбриона 7 недель гестации;

Г — в зоне воспаления при хроническом гепатите

 

Присутствие C-met в мезенхимных клетках [интенсивная экспрессия], гепатобластах [умеренная экспрессия] и гепатоцитах [слабая экспрессия] позволяет говорить о существовании клеток с переходным фенотипом и предполагать, что синусоидные клетки, экспрессирующие C-met, могут быть предшественниками гепатоцитов, то есть данный протеин появляется в клетках, которые, имея мезенхимное происхождение, становятся на путь дифференцировки в эпителий. Учитывая то, что C-met является рецептором к фактору роста гепатоцитов, который также называют рассеивающим фактором [26, 27], можно предположить также, что экспрессирующие данный белок клетки являются подвижными и могут далее распространяться в другие области печени. По мере дифференцировки клеток экспрессия рецептора к фактору роста гепатоцитов постепенно уменьшается [о чем свидетельствует снижение интенсивности окрашивания дифференцированных клеткок — гепатоцитов]. Наличие единичных C-met⁺ клеток около сосудов позволяет предполагать, что эти клетки могут поступать в печень не только из мезенхимы поперечной перегородки, но и с кровью.

С 4,5-5 недель гестации все гепатобласты слабо экспрессировали C-kit [CD117] — рецептор к фактору стволовых клеток, маркер кроветворных стволовых клеток. Через неделю периферия печени на границе с мезенхимой окрашивалась сильнее, а с 5,5-6 недели около сосудов появлялись ярко окрашенные единичные гепатоциты [максимальное число таких клеток выявлено на 7-й неделе гестации] и единичные отростчатые синусоидные клетки [рис. 4А]. Последние сохранялись в печени на всех изученных нами сроках гестации.

Удивительной находкой стало обнаружение экспрессии C-kit в гепатоцитах регенерирующей печени крысы. Через сутки после частичной гепатэктомии можно было видеть единичные и сгруппированные гепатоциты. Их число оставалось неизменным до конца эксперимента [рис. 4Б]. Через двое суток после введения нитрата свинца появлялись единичные и сгруппированные C-kit-позитивные гепатоциты, через 3 суток их число снижалось, и к 5 суткам такие клетки исчезали. Мы также обнаружили экспрессию C-kit в синусоидных клетках: через сутки после начала экспериментов выявлялись многочисленные мелкие вытянутые клетки, экспрессирующие этот белок [рис. 4В]. По мере восстановления паренхимы печени в ходе регенерации число их несколько уменьшалось.

Похожие закономерности были установлены и при изучении регенерации печени человека — C-kit-позитивные клетки выявлены в зонах портального некроза и воспаления, также экспрессия этого рецептора обнаружена в синусоидных клетках [рис. 4Г]. Число C-kit⁺ клеток зависело от тяжести гепатита: оно нарастало пропорционально тяжести заболевания, достигало максимума при умеренном гепатите, а затем постепенно снижалось.

 

Рис. 4. Экспрессия C-kit в эмбриогенезе (А) и при регенерации (Б, В, Г).

Продукт иммуногистохимической реакции - красного цвета, х400:

А — в синусоидных клетках эмбриона 5-6 недель гестации;

Б — в гепатоцитах крысы через 3 суток после частичной гепатэктомии;

В — в синусоидных клетках [стрелки] печени через 3 суток после частичной гепатэктомии;

Г — в воспалительном инфильтрате при хроническом гепатите

 

Полученные результаты, таким образом, также подтверждают стволовые потенции синусоидных клеток печени. Присутствие C-kit в гепатобластах на ранних сроках гестации [4,5-5 недели], по-видимому, указывает на чувствительность этих клеток к фактору стволовых клеток. Установлено, что выделенные из печени C-kit⁺ клетки делятся в культуре, и в них появляется альбумин [28], то есть они могут быть предшественниками гепатоцитов. Учитывая, что C-kit является маркером кроветворных стволовых клеток, можно предположить, что в период становления печеночного кроветворения [6-7 недели гестации], а также при регенерации печени часть гепатоцитов может образовываться из кроветворных стволовых клеток. Однако массовое участие кроветворных стволовых клеток в развитии гепатоцитов вызывает сомнения, поскольку в гистогенезе печени число C-kit⁺ клеток не было достаточно большим, чтобы определять течение и исход данных событий. Более вероятно, на наш взгляд, что кроветворные стволовые клетки играют определенную роль в восстановлении пула региональных стволовых клеток, по- видимому — синусоидных. Это подтверждают и данные других авторов. Показано, что в 3-8% CD34⁺ клеток [CD34 — один из маркеров кроветворных стволовых клеток], изолированных из печени человека 14-22 недель гестации, могут экспрессироваться цитокератины, десмин и некоторые другие маркеры перисинусоидальных клеток [29], что не исключает возможности дифференцировки CD34⁺ стволовой кроветворной клетки в десмин-позитивную перисину- соидальную клетку, а затем — в цитокератин-позитивный гепатобласт. Однако, учитывая малочисленность C-kit-позитивных клеток в эмбриональной печени, очевидно, что число таких гепатоцитов вряд ли будет значительным.

Обнаружение экспрессии C-kit в многочисленных синусоидных клетках печени и в единичных гепатоцитах в ходе регенерации также позволяет сделать вывод, что, несмотря на отсутствие в печени овальных клеток, может происходить активация регионального стволового компартмента, локализованного в синусоидах. Можно предположить, что C-kit⁺ синусоидные клетки дают начало гепатобластам, также экспрессирующим C-kit. Поскольку гепатобласты являются клетками дифференцирующимися, в ходе этого процесса они постепенно утрачивают способность экспрессировать рецептор к фактору стволовых клеток, и мы видим лишь единичные C-kit⁺ гепатоциты.

Выдвинутая нами гипотеза о возможности развития гепатоцитов из мезенхимных клеток поперечной перегородки и о перисинусоидальных клетках, как региональных стволовых клетках печени, находит в последние годы все больше подтверждений в работах других исследователей. Так, установлена возможность образования гепатоцитов из мезенхимных клеток, выделенных из жировой ткани человека in vitro и in vivo [ЗО] и из мезенхимных стволовых клеток in vitro [31, 32]. Было показано, что после трансплантации летально облученным крысам клеток красного костного мозга последние могут давать начало овальным клеткам и гепатоцитам [33]. Позднее подобные эксперименты с аналогичными результатами были проведены на мышах [6, 34, 35]. Появились данные об образовании перисинусоидальных клеток из стволовых кроветворных клеток у мышей [36]. И, наконец, в 2006 году опубликована статья, в которой впервые пери- синусоидальные клетки рассматриваются как стволовые клетки, поскольку экспрессируют один из маркеров кроветворных стволовых клеток CD133 [37]. Подводя итог, можно сказать, что установленный нами факт существования в печени и окружающей ее мезенхиме клеток, сочетающих фенотипические признаки прогениторных клеток, перисинусоидальных клеток печени и гепатоцитов, свидетельствует о возможности развития гепатоцитов из десмин-позитивных клеток мезенхимы поперечной перегородки, что вплотную приближает нас к разгадке вопроса о региональной стволовой клетке печени, которой может являться популяция звёздчатых перисинусоидальных клеток [клеток Ито].

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ [грант 04-04-49164] и Федеральной целевой программы [государственный контракт 02.512.11.2052 от 27.02.2007].

About the authors

A. A. Gumerova

Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

A. P. Kiasov

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

M. S. Kaligin

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

I. M. Gazizov

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

S. R. Abdulkhakov

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

D. l. Andreeva

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

M. A. Titova

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

T. S. Smetannikova

Kazan State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files