Cell Populations Isolated from Cord Blood and Placental Tissues: Difficulties and Perspectives of Use

Full Text

Стволовые клетки [СК] пуповинной крови [ПК] за последние 5 лет все чаще рассматривают как объективную альтернативу другим источникам СК взрослых. Данное обстоятельство обусловлено сообщениями о выделении, характеристике и экспансии in vitro все новых популяций СК из пуповинной крови, что позволяет расширить возможности их клинического использования и банкирования.

Клеточные популяции, выделяемые из пуповинной крови и пупочного канатика

Группа гемопоэтических клеток

Традиционно к этой популяции относят прежде всего CD34⁺ клетки, однако помимо них данная группа включает и их более дифференцированные клеточные формы.

Предшественники лимфоцитов

В работе японских ученых описаны выделение и иммунофенотипическая характеристика Т-регуляторных клеток человека. Клетки выделили после проведения совместного культивирования Т-клеток ПК со стромальными клетками костного мозга мышей без добавления каких-либо цитокинов. Полученные клетки имели иммунофенотип FGXP3⁺CD4⁺CD8⁺CD25⁺n обладали супрессорной активностью в отношении аллогенных антигенпрезентирующих клеток в смешанной культуре лимфоцитов, где в качестве клеток-активаторов использовали дендритные клетки, также выделенные из ПК. Кроме того, после активации цитокинами они были способны продуцировать IL-1O, а также обладали цитотоксической активностью [1].

Предшественники моноцитов

Авторы работы применили двухэтапную стратегию выделения: выделив из пуповинной крови сначала CD34⁺ клетки, подвергли их кратковременной экспансии в течение 3-10 дней. После того, как исследователям удалось добиться 80-кратного увеличения общего числа клеток, они были помещены в дифференцировочную среду. Через 7 дней практически все клетки [98%) коэкспрессировали CD34 и CD38, т.е. происходило явное уменьшение количества чистой CD34⁺/lin- фракции. Около 40% клеток экспрессировали CD14, и 20% - CD16. CD14⁺ фракцию моноцитов можно было разделить на субпопуляции: CD14⁺/CD16⁺ и С014⁺/ 0016. Однако, выделенные С014⁺ клетки не пролиферировали в культуре [2].

Другие авторы выделили клетки с иммунофенотипом С034⁺/С0133⁺ и подвергли генетическому микроанализу [55 тыс. генов], а также провели анализ генной экспрессии методом SAGE [Serial analysis of gene expression] [3]. Выяснилось, что с культивированием этого пула клеток связана экспрессия нескольких протоонкогенов. Кроме того, оказалось, что экспрессия нескольких опухолевых супрессоров, наоборот, была подавлена [DGCK4 и SPARCL1].  Для гибридизации использовали также некультивированные свежевыделенные клетки. В целом 851 ген [синтез и процессинг РНК, метаболизм белков, синтез АТФ] оказался активирован, а экспрессия 991 других, наоборот - подавлена [в основном - регуляция транскрипции, внутриклеточный сигналинг]. Выделенные клетки подвергли экспансии в культуре [в присутствии факторов роста и эстрадиола], при этом количество CD34⁺/CD133⁺ клеток было максимальным на 7-й день [примерно в 10 раз по сравнению с исходным выделенным количеством]. Эти клетки также были проанализированы с использованием генного чипирования, а результаты свидетельствовали об активации групп генов, нарушение работы которых традиционно связано с развитием злокачественных новообразований. Например, группы генов, ответственных за апоптоз «молчали», тогда как работа Wnt, MEK/ERK и Notch сигнальных путей была нарушена. Аналогичные изменения показаны при таких состояниях, как миелобластный лейкоз и Т-клеточная лимфобластная лимфома. Таким образом, следует предположить, что in vitro экспансия CD34⁺/CD133⁺ клеток ведет к началу их онкотрансформации.

Предшественники дендритных клеток

ПК имеет меньшее количество зрелых дендритных клеток, чем кровь взрослых, эти клетки синтезируют меньшие количества а-интерферона и фактора некроза опухолей. Однако, клетки из ПК обладают лучшей способностью к активации Т-регуляторных CD4⁺ клеток. Таким образом, предшественники дендритных клеток из ПК могут рассматриваться как клетки, обеспечивающие микроокружение для созревания Т-регуляторных клеток. Этот факт в свою очередь может объяснять невыраженный иммунный ответ при трансплантации клеток ПК [4].

При культивировании в течение 2 недель мононуклеарных клеток из ПК с фенотипом CD34⁺ из них получили Т-лимфоциты [«незрелые» CD4⁺CD8⁺/CD4⁺CD8~ и зрелые CD3⁺CD4⁺ клетки], а также CD1a⁺ дендритные клетки со стабильным уровнем экспрессии HLA-DR. Количество клеток обоих типов сравнивали с количеством клеток, произошедших от некультивированных CD34⁺ предшественников и от клеток, выделенных непосредственно из тимуса. Обе популяции были способны восстанавливать гемопоэз у сублетально облученных мышей NGD/SCID. Таким образом, исследователи доказали, что предварительное культивирование CD34⁺ предшественников не влияет на количество и функциональную активность их потомков - Т-лимфоцитов и дендритных клеток [5].

В другой работе, однако, предшественниками дендритных клеток называют клетки с фенотипом CD133⁺CD34-Lin⁺ [6].Точнее, исследователи доказали, что CD133'CD34 , полученные в культуре, являются прямыми Lin⁺ потомками клеток с фенотипом CD133⁺CD34⁺, которые способны дифференцироваться в дендритные клетки, то есть CD133⁺CD34⁺ дают начало CD133'CD34 Lin-предшественникам дендритных клеток.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

Пуповинную кровь можно отнести к перспективному источнику мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [ММСК]. Показано, что из ПК выделяется популяция фибробластоподобных адгезивных к пластику, способных к дивергентной дифференцировке клеток с иммунофенотипом CD29⁺CD44⁺CD73⁺CD9O⁺CD1O5⁺/CD11 b~CD34~ CD45 CD31 [7]. Анализ паттерна генной экспрессии [Affymetrix HG - U133] свидетельствует об активности генов раннего и позднего эмбриогенеза, например, PGU5F1/ ОСТ4, компонентов сигнального пути Wnt, GATA6, leukemia inhibitory factor [LIF], STATS, SUZ12 [компонент белкового комплекса PRC1, группа белков Polycomb], фоллистатина, рецептора NGTCH2, а также генов «домашнего хозяйства» [homeobox genes] SIX1, PITX1, HGXD11, ННЕХ. Не выявлено экспрессии генов ангиогенеза или кардиомиогенных белков. Кроме того, исследователи доказали значительное увеличение уровня экспрессии генов SDF-1 и HGF. Первая молекула отвечает за направленную миграцию клеток, а фактор роста гепатоцитов снижает уровень апоптоза и является стимулятором процесса ангиогенеза. Исследователи предлагают использовать эти молекулы как маркеры ММСК из ПК.

Полученные результаты сравнивали с генной экспрессией ММСК из костного мозга [КМ], культивируемых в аналогичных условиях. Оказалось, что две популяции ММСК [из КМ и из ПК] демонстрируют значимые различия, а именно, в клетках из ПК был обнаружен повышенный уровень экспрессии фоллистатина, при этом гены, кодирующие белки внеклеточного матрикса [ВКМ], были слабо-экспрессированы [например, коллаген VIII alpha 1], кроме того ММСК ПК были способны к более интенсивной пролиферации, чем клетки КМ.

ММСК были выделены из ПК не только человека, но из ПК таких видов как лошадь, овца и собака [8-10].

Стоит также упомянуть, что плюрипотентные фибробластоподобные клетки из ПК часто называют Unrestricted somatic stem cells [USSCs], или соматические стволовые клетки с «неограниченным» потенциалом.

Продемонстрирована нейрональная дифференцировка ММСК из ПК [11]. Адгезивные клетки из ПК были помещены в нейрогенную среду, а через 1,2 и 7 дней их анализировали на наличие нейрональных маркеров. Клетки экспрессировали белки нейрофиламентов [NF], кислый фибриллярный глиальный белок [GFAP].

Некоторые исследователи сообщают о дифференцировке ММСК из ПК в кардиомиоциты [12]. При совместном культивировании человеческих ММСК из ПК с постнатальными кардиомиоцитами грызунов [обе группы клеток были разделены коллагеновой мембраной, чтобы избежать слияния] было отмечено, что человеческие клетки [примерно 50%] начинали экспрессировать troponin-l и connexin 43. Кроме того, клетки были способны генерировать сокращения. Таким образом исследователи предлагают рассматривать ММСК из ПК в качестве источника кардиомиоцитов при заместительной клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Также к ММСК можно отнести клетки, выделенные в 2005 году из перивазальной ткани пупочного канатика [13]. Их иммунофенотип - CD45~CD34~SH2⁺SH3⁺Thy-1⁺CD44⁺. Они были способны формировать колонии на пластике, экспрессировать а-актин, десмин, виментин и 305-маркер перицитов, а также дифференцироваться в остеогенном и хондрогенном направлениях.

Предшественники эндотелиальных клеток и эндотелиоциты

Часто пуповинную кровь, а также вену пупочного канатика рассматривают как источник эндотелиальных клеток. Клеточная фракция HUVEC [эндотелий вены пупочного канатика, human umbilical cord vein endothelial cells] является рутинновыделяемой группой эндотелиальных клеток человека [14]. Показано, что эти клетки способны поддерживать гемопоэз, обеспечивая CD34⁺ ГСК необходимым микроокружением [15].

При сравнении эндотелиальных предшественников из пуповинной крови и эндотелия из стенки пупочной вены [HUVEC] оказалось, что HUVEC способны дифференцироваться, давая начало более зрелым потомкам. Для них также был показан клональный рост и высокая способность к пролиферации, таким образом, не все исследователи рассматривают HUVEC как фракцию полностью дифференцированных эндотелиоцитов [16].

Установлено, что так называемые «поздние» эндотелиальные предшественники происходят от немногочисленной CD34⁺CD45 фракции, а не из CD34⁺CD45⁺ пула клеток. При этом потомки CD34'CD45 клеток экспрессировали VEGFR2 и не экспрессировали CD133, тогда как потомки CD34⁺CD45⁺ демонстрировали экспрессию CD 133 [17]. Кроме того, высокоочищенная фракция CD133⁺ клеток вообще не была способна давать начало эндотелиальным клеткам. Из этих данных ученые сделали вывод о том, что гемопоэтические предшественники, экспрессирующие CD133 и CD45, не могут быть источником «поздних» предшественников эндотелия, как считалось ранее [16]. Поэтому исследователи предлагают использовать следующие признаки, на основе которых можно проводить выделение эндотелиальных предшественников из ПК: коэкспрессия CD31 и CD34, VEGFR2, способность к захвату липопротеинов низкой плотности, а также типичная «черепицеобразная» морфология и способность к формированию сосудистых трубочек in vitro.

Другие авторы считают предшественниками эндотелия [а также и ГСК] CD34⁺CD133⁺ клетки [18]. На разных средах эта популяция формировала адгезивный монослой клеток, экспрессирующих VE-cadherin⁺CD45 VEGF R2⁺, а также давала начало неприкрепляющимся клеткам, формировавшим колонии на метилцеллюлозе и экспрессировавшим CD45⁺.

В работе японских ученых эндотелиальные предшественники CD45-CD31⁺CD1O5⁺, составлявшие 2,7±1,0% от всей мононуклеарной фракции, выделяли на основании экспрессии альдегиддегидрогеназы [19]. Выяснилось, что клетки с низким уровнем активности этого фермента обладают большей способностью к миграции и пролиферации. В условиях гипоксии клетки первой субпопуляции демонстрировали высокий уровень экспрессии мРНК hypoxia-inducible factor proteins, VEGF, CXCR4, и GLUT-1. Кроме того, действие клеток с низкой активностью альдегиддегидрогеназы сравнивали с клетками HUVEC и клетками второй субпопуляции при проведении эксперимента по стимуляции ангиогенеза in vivo на модели приживления кожного лоскута. Клетки первой субпопуляции способствовали значительно более быстрому заживлению кожной раны, формируя под ней обширную сосудистую сеть. Авторы работы предлагают использовать активность альдегиддегидрогеназы в качестве специфического признака эндотелиальных клеток ПК, поскольку она не изменяется в процессе культивирования.

Экспансия ex vivo

Применение СК из ПК у взрослых пациентов ограничено небольшим объемом образца крови, а значит и недостаточным количеством клеток для человека массой больше 40 кг [20]. Результатом этого является отложенное [замедленное] приживление трансплантата, кратко- и долговременные риски инфекционных осложнений. Первые попытки осуществить увеличение количества клеток, прежде всего гемопоэтических стволовых клеток [ГСК], привели к неизбежному наращиванию количества более дифференцированных клеток в культуре. Следовательно, экспансия ex vivo не улучшала эффективность приживления, т.к. увеличивался уровень апоптоза пересаженных клеток и снижался уровень заселения костного мозга [21].

Будущее такого направления, как увеличение количества незрелых гемопоэтических предшественников, лежит в области выделения этих клеток на основании их функционирования, а не на основании их поверхностного фенотипа, что, кроме того, подразумевает учитывание влияния цитокинов и стромы в формировании и работы ниши ГСК [20].

Оптимизация культуральной среды для ГСК

Для обеспечения пролонгированного культивирования [обычно, не более 3 недель] ГСК необходимо обеспечить несколько действующих факторов:

- присутствие необходимых факторов роста в среде культивирования;

- присутствие стромального компонента [матрицы] для имитации ниши ГСК [лучшим фидером по-прежнему считают ММСК костного мозга].

Популяцией, наиболее подходящей для длительного культивирования, называют CD133⁺ клетки, которые являются менее дифференцированными, чем CD34⁺ предшественники, кроме того, известно, что экспрессия CD34⁺ в культуре крайне нестабильна [21, 22].

Оптимальный состав цитокинов в среде ГСК из ПК точно не определен. Однако в числе таких молекул называют SCF, FL [Flt3-ligand] и ТРО [тромбопоэтин, который по некоторым данным может заменить в среде IL-3, IL-6 и G-CSF]. На данный момент также проводятся эксперименты с использованием знаний о сигнальных путях, регулирующих жизнедеятельность ГСК. Основным путем является Notch [задействован в процессе дифференцировки клеток в эмбриогенезе] при добавлении лигандов Notch.

Другим подходом может служит использование данных эпигенетики о поддержании самообновляющегося «юного» статуса ГСК. Так, в работе [23] предлагают использовать хроматин-модифицирующие и гистон-модифицирующие агенты для торможения транскрипции, что позволяет клеткам в культуре дольше поддерживать недифференцированное состояние.

Кроме того, опубликованы данные, которые свидетельствуют о том, что материнская плазма или просто человеческий альбумин, используемый при выделении CD34⁺ клеток, способствует обогащению этой фракции [24]. Во время выделения обогащенной CD34⁺ фракции вместо фетальной бычьей сыворотки использовали плазму матери, при экспансии клеток их количество увеличивалось в 1,8 раза.

Генетическая модификация клеток

Одно из направлений работы с клетками ПК составляют исследования генетически измененных in vitro клеток. Так, мононуклеарные клетки могут быть использованы в качестве переносчиков гена VEGF для обеспечения терапевтического ангиогенеза [25]. В другой работе для трансфекции выбрали CD34⁺ клетки, а низкоаффинный рецептор фактора роста нервов использовался в качестве трансгена в ретровирусном переносчике. Трансфицированные клетки применяли для трех последовательных трансплантаций nod/scid мышам. При анализе поколений гемопоэтических клеток у этих животных была выявлена стабильная экспрессия трансгена уже в CD45⁺ клетках [без нарушения способности к длительному восстановлению гемопоэза] [26].

Вакцины на основе измененных дендритных клеток представляют особый интерес при поиске альтернативных способов лечения рака. Для того, чтобы выяснить, можно ли «нагрузить» дендритные клетки антигенами в иммунотерапевтических целях, выделенные из ПК дендритные клетки с помощью электропорации трансфицировали вектором, несущим EGFP [27]. Выяснилось, что клетки хорошо экспрессируют трансген, однако процент HLA-DR⁺/lin клеток [собственно антигенпрезентирующие дендритные клетки] не превысил 2,5%, что явно недостаточно для терапевтических целей [27]. Кроме того, для этой процедуры применяют и лентивирусные вектора [28]. Так, клетки из ПК [обогащенная CD34⁺ фракция] трансфицировали самоинактивирующимся лентивирусом, несущим ген ß-глобина [для терапии серповидноклеточной анемии и талассемии]. В дальнейшем клетки пересаживали сублетально облученным мышам линии NOD/LtSz-scid/scid. Полученные в течение 6 месяцев после трансплантации поколения клеток анализировали и обнаружили, что около половины эритроидных и миелоидных предшественников экспрессируют трансген. А эритроидные клетки содержали большое количество белка ß-глобина.

Клетки, выделяемые из амниотической жидкости, амниона и плаценты

Не так давно амниотическая жидкость и плацента также стали рассматриваться исследователями и клиницистами как источники клеток-предшественников. Так, исследовательской группой, возглавляемой признанным авторитетом в области тканевой инженерии Antony Atala, линии СК, обладающих некоторыми признаками плюрипотентности, были выделены из амниотической жидкости [СКАЖ] человека. В течение последних нескольких лет разными лабораториями неоднократно сообщалось о выделении популяций стволовых или прогениторных клеток из амниотической жидкости человека, аналогичных по свойствам ММСК костного мозга [29]. В данной работе популяция стволовых клеток близкая по свойствам к ЭСК, выделенная из амниотической жидкости была охарактиризована впервые.

Известно, что амниотическая жидкость содержит гетерогенную популяцию клеток, полученных от зародыша и амниона. Исследователи выделяли c-kit⁺ клетки из амниотической жидкости, которую обычно получают на сроках от 16 до 20 недель беременности для определения риска развития генетических заболеваний и пренатальной диагностики. Как правило, образец содержал 10-20 мл исследуемой жидкости. СКАЖ количественно представляли собой лишь 1% от всех выделенных клеток жидкости. Через неделю медленной пролиферации в культуре они прикрепляются к пластику и пассируются каждые 2-3 дня. Клетки обладают высокой пролиферативной способностью и могут претерпевать до 250 делений без каких-либо обнаруживаемых укорачиваний теломер. Кроме того, авторы культивировали клетки без фидера, что также является неоспоримым достоинством при рассмотрении возможности терапевтического использования. Способность клеток к клональному росту определяли после использования метода лимитирующих разведений. Фенотипически СКАЖ экспрессировали MHC-I/HLA-ABC, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и были негативны по экспрессии антигенов-маркеров гемопоэтического ряда - CD34, CD133C, CD45.

Показано, что СКАЖ способны к дифференцировке в ткани всех трёх зародышевых листков. Используя специфические дифференцировочные среды и условия культивирования удалось получить нестин-позитивные клетки, а затем и дофаминэргические клетки и нейроны, несущие рецепторы к глутамату. Эти клетки были способны выживать в латеральном желудочке мозга мышей, распространяясь по головному мозгу, и не вызывать опухолевого роста.

При определенных условиях СКАЖ также были способны формировать функциональные остеобласты, которые продуцировали остеоид при пересадке в альгинате/коллагене иммунодефицитным мышам. Из СКАЖ были получены клетки, экспрессирующие альбумин и а-фетопротеин, гепатоцитарный ядерный фактор, фактор роста гепатоцитов, а также секретирующие мочевину. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что из СКАЖ были получены предшественники гепатоцитов. Кроме того, данные исследования свидетельствуют в пользу получения лейомиоцитов, адипоцитов и эндотелиальных клеток из СКАЖ.

Несмотря на то, что происхождение выделенных клеток остается неясным, исследователи предполагают, что клетки происходят непосредственно от амниона, который, в свою очередь, берет начало от эпибласта дифференцирующейся бластоцисты. Как следствие, именно эпибласту клетки СКАЖ могут быть обязаны своей мультипотентностью. СКАЖ экспрессируют ряд маркеров, использующихся для оценки плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток [ЭСК], таких как Cct4 и SSEA4, однако не экспрессируют остальные характерные молекулы ЭСК. Интересно, что СКАЖ фенотипически [CD90⁺CD105⁺] и по культуральным свойствам [адгезия к пластику] очень похожи на ММСК, однако отличаются экспрессией маркёров плюрипотентности, большим пролиферативным потенциалом и пластичностью. При проверке СКАЖ на туморогенность не было обнаружено формирования тератом, в отличие ЭСК.

Таким образом, c-kit⁺ СКАЖ могут представлять собой онтогенетически промежуточный вариант между ЭСК и стволовыми клетками взрослых и, соответственно, новый класс клеток с привлекательными свойствами пластичности широкого диапазона без видимого риска формирования новообразований. Очень важно, что СКАЖ можно культивировать без использования ксеногенного фидера, что должно ускорить их использование в клинике.

Весьма перспективным направлением может стать банкирование гистосовместимых СКАЖ, а также их типирование и использование для аллогенных пересадок.

По другим данным, клетки из амниотической жидкости предлагают использовать для оптимизации регенерации почки [30]. Сообщается о выделении мультипотентных клеток из амниотической жидкости человека на 12-18-й неделе гестации. In vitro клетки были помечены зеленым флуоресцентным белком и пересажены в почку эмбрионам мыши на 12,5-18 день пренатального развития. Систему поддерживали in vitro в течение 10 дней. С помощью методов прижизненной микроскопии, ПЦР, FISH была изучена интеграция и дифференцировка клеток человека в микроокружении эмбриональной почки мыши. По результатам исследования оказалось, что человеческие клетки способны не только выживать в подобной системе, но и активно интегрироваться в развивающиеся почечные структуры [канальцы], сосуды, экспрессировать ранние маркеры клеток почечного эпителия.

В работе тайваньских исследователей проанализирована способность клеток, выделенных из амниотической жидкости, активировать регенерацию седалищного нерва у крыс [31]. Им удалось доказать, что клетки секретируют нейротрофический фактор. Нарушение работы седалищного нерва проводили пережатием сосуда, снабжающего его кровью. Клетки, выделенные из амниотической жидкости крыс той же линии, были заключены в фибриновый гель и помещены в место повреждения. С помощью иммуносорбентного анализа и иммуноцитохимии была проанализирована экспрессия нейротрофического фактора. Регенерация нерва приводила к восстановлению локомоторной функции конечностей подопытных животных. На самих клетках была отмечена экспрессия следующих молекул: CD29'CD44'CD11b'CD45 , а также высокие уровни нейротрофического фактора, полученного из мозга [brain-derived neurotrophic factor], нейротрофического фактора, полученного из глии [glia cell line-derived neurotrophic factor], фактора роста нервов и нейротрофина-3. Следовательно, СКАЖ можно рассматривать как клеточный источник для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Кроме того, такие клетки уже предлагают использовать в пренатальной тканевой инженерии клапанов сердца [33]. Выделенные на магнитных сферах из амниотической жидкости CD133⁺ клетки претерпевали экспансию и дифференцировку. После чего СС133-клетки [которые образовались за время культивирования] были посажены на матрицы-носители, по форме повторяющие клапаны сердца. Матрица представляла собой быстро деградируемый полимер. Затем на полученные образцы наносили CD133⁺ клетки и выдерживали в культуральной системе с пульсирующей струей. В системе биоискусственного трансплантата происходила эндотелизация поверхности и синтез белков внеклеточного матриска. В одной из последних работ лидирующей в этом направлении группы американского тканевого инженера Antony Atala сообщается о хондрогенной дифференцировке клеток СКАЖ [33]. Для восстановления поврежденной хрящевой ткани, как правило, требуется значительное количество клеток. Был проанализирован хондрогенный потенциал человеческих СКАЖ в суспензии и альгинатной капле. Клетки подвергли экспансии в различных средах в течение трех недель. После этого был зафиксирован повышенный уровень экспрессии сульфатированных гликозаминогликанов и коллагена II типа. Однако, по сравнению с ММСК, клетки СКАЖ секретировали меньшее количество белков внеклеточного матрикса.

В другой работе сообщается о том, что клетки из амниона способны дифференцироваться в гепатоциты [34]. В работе проанализировали экспрессию генов, характерных для гепатоцитов [мРНК альбумина, а-фетопротеина, цитокератина 18, а-антитрипсина]. Кроме того, исследователи также наблюдали накопление гликогена в этих клетках.

Данной популяции клеток также приписывают иммуномодулирующие свойства [35]. При сравнение иммуномодулирующего потенциала клеток из амниона, амниотической жидкости и фибробластов подкожной клетчатки оказалось, что все три типа клеток оказывают ингибирующее действие в экспериментах с лимфоцитами периферической крови и системе «transwell», что доказывает механизм подавления пролиферации лимфоцитов посредством межклеточных контактов.

Несмотря на то, что была показана способность клеток из амниотической жидкости дифференцироваться в эндотелий [36], при их введении крысам с инфарктом миокарда не было отмечено никакого значимого улучшения работы сердца, а пересаженные клетки быстро гибли [37].

Плацента также рассматривается как источник СК [38, 39]. Показано, что плацента содержит большое количество различных популяций клеток-предшественников. Например, в работе японских ученых эти клетки характеризовала экспрессия таких маркеров как SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60 и TRA 1-81. Однако такие клетки были в стенке амниона, а не в хориодецидуальной оболочке [которая содержит клетки гемопоэтического ряда, а также клетки трофобласта].

Сообщается о получении инсулинпродуцирующих клетокиз плаценты. Выделенные клетки культивировали в монослое в среде без сыворотки с добавлением факторов роста, через 4 недели клетки формировали сфероиды. ПЦР выявила экспрессию мРНК генов Pdx1,8ох17 и Foxa2. С помощью иммуноферментного анализа была зафиксирована секреция инсулина. А при пересадке данных сфероидов мышам со стрептозотоцин-индуцированным диабетом происходило восстановление нормального уровня глюкозы в крови подопытных мышей. Авторы работы рекомендуют рассматривать клетки из плаценты в качестве кандидатов для борьбы с диабетом.

Спектр клеток, выделяемых из пуповинной крови, плаценты и амниотической жидкости

На последней конференции по вопросам номенклатуры, фенотипирования клеток из плацентарных тканей и этических проблем их использования в 2007 году постановили [40]:

1. Клетки из всех плацентарных тканей следует называть мезенхимальными стромальными клетками.
2. Основные критерии их определения:

• способность прикрепляться к пластику;
• формирование фибробластоподобных колоний;
• специфический паттерн экспрессии поверхностных антигенов [CD90\CD105\CD73⁺ и 0045/0034/0014/ HLA-DR-);
• дифференцировочный потенциал - способность дифференцироваться в клетки остеогенного, хондрогенного, адипогенного и эндотелиального ряда.

В большинстве приведенных работ клетки выделяют следующим образом. Для выделения эпителиальных клеток амниотическую мембрану отделяют и диссоциируют с помощью трипсина или других ферментов. Именно такие клетки характеризуются экспрессией ABCG2/BCRP, CD9, CD24, Е-кадгерина, а и ß-интегринов, c-met [HGF receptor], SSEA 3 и 4 TRA 1-60 и 1-81 [41]. Отдельно выделяют клетки хориона [первого или третьего триместров]. При этом клетки хориона также выделяют с помощью ферментативной диссоциации. Фенотипическим признаком, отличающим мезенхимальные стромальные клетки амниона от таковых плаценты, называют экспрессию CD49d [а4 integrin] - на клетках амниона он присутствует [42]. Существует работа, показывающая значительную способность клеток к приживлению в организме свиньи и крысы [43]. Так, был продемонстрирован донорский химеризм в мозге, легких, костном мозге, тимусе, селезенке, почках и печени после трансплантации человеческих клеток амниона и хориона. Мигрирующие клетки имели следующий фенотип: L-selectin, VLA-5, CD29, P-selectin Ligand 1, а также экспрессировали матриксные металлопротеиназы [ММР-2 and ММР-9].

Доклинические модели:

1. Регенерация печени [41].
2. Регенерация сердечной мышечной ткани [44]. Совместное культивирование с кардиомиоцитами грызунов способствовало кардиомиогенной дифференцировке СКАЖ. Кроме того, клетки были способны интегрироваться в миокард и выживать как минимум в течение 2 месяцев после трансплантации.
3. Нейродегенеративные заболевания. На крысиной модели болезни Паркинсона СКАЖ способствовали выживанию нейронов черной субстанции мозга [45]. В другой работе клетки также пересаживали в поврежденный спинной мозг приматов, где они противостояли гибели моторных нейронов и способствовали формированию новых аксонов [46].

Таким образом, все приведенные данные свидетельствуют в пользу того, что комплекс тканей плаценты обладает большим количеством групп предшественников, хотя и недостаточно изученных, однако имеющих регенеративный потенциал, что было доказано в ходе доклинических исследований.

Возможности тканевой инженерии с использованием клеток из пуповинно-плацентарного комплекса

В 2006 году была опубликована работа, в которой группой исследователей из Швейцарии было описано получение клапана сердца с использованием клеток, выделенных из ПК и «вартонова студня» [47].

Клетки из обоих источников были последовательно помещены на биодеградируемый матрикс и подвергнуты культивированию в биомиметической системе [система, по основным химическим и физическим показательям приближенная к таковым в организме млекопитающих]. Клетки, выделенные из «вартонова студня» [Wharton's Jelly], по экспрессии поверхностных маркеров можно было охарактеризовать как миофибробласты, фибробласты и эндотелиальные клетки. Матрица для заселения была представлена сеткой из полигликолиевой кислоты толщиной 1 мм. Матрицы были прикреплены к кольцевым опорам, миофибробласты были помещены на матрицы с помощью фибрина. Одна конструкция была помещена в биореактор, повторяющий условия тока крови в работающем сердце [перфузия и механическое напряжение], а вторая оставлена в статических условиях. Через 14 дней те же конструкции были дополнительно заселены эндотелиальными клетками из ПК и помещены на 48 часов в обычный инкубатор, а затем еще на 5 дней - в биореактор. Полученные тканеинженерные клапаны были проанализированы. При этом выяснилось, что образцы, помещенные в статические условия, не демонстрировали собственно тканеобразования, клетки хоть и присутствовали на носителях в большом количестве, но не секретировали белки ВКМ и не формировали никаких структур. При анализе образцов, помещенных в биореактор, оказалось, что происходит формирование нескольких хорошо выраженных слоев клеток [эндотелий, миофибробласты, слой белков ВКМ - коллаген, гликозаминогликаны и фибробласты между ними], более того, полученные конструкции обладали упругостью и способностью к противостоянию механическому стрессу [хотя она и не достигла физиологических значений]. Данный эксперимент может лечь в основу новых разработок при борьбе с врожденными пороками развития сердечно-сосудистой системы.

Другим примером может служить совместная работа американских и немецких ученых, направленная на замещение дефекта бедренной кости значительного размера с использованием ММСК из ПК [48]. ММСК были заселены в матрицы из коллагена и ß-трикальций фосфата [collagen I/ III and ß3-tricalcium phosphate] и имплантированы 40 крысам линии nude с дефектом бедренной кости размером 4 мм. Через 10 недель исследователи оценивали количество выживших клеток, их миграцию, интенсивность остеогенеза с помощью рентгенографии и иммуногистохимического анализа. По результатам эксперимента оказалось, что человеческие клетки хорошо прикрепляются к подложке [из ß-три-кальций фосфата] и мигрируют на края опила кости животного, выживая вплоть до 4-й недели наблюдения. Однако на следующих сроках человеческие клетки распознаются и уничтожаются организмом хозяина. Несмотря на это, темпы регенерации кости были гораздо более интенсивными по сравнению с контрольными животными [использовали только матрицу без клеток].

Таким образом, клетки из пуповинно-плацентарного комплекса могут служить биоактивным компонентом и при моделировании и разработке остеогенных тканеинженерных конструкций. Также сообщается об успешном использовании мононуклеарных клеток ПК на коллагеновых матрицах при преодолении последствий экспериментального инфаркта миокарда у мышей [49]. Кроме того, для тканевой инженерии хрящевой ткани также используют ММСК ПК [50].

Однако одним из наиболее перспективных направлений является использование клеток ПК и самой пупочной вены при моделировании сосудов [51, 52]. Исследователи предлагают использовать не только собственно эндотелий сосудов, но и сами изолированные сосуды целиком для последующего формирования сосудов разного диаметра и длины с последующей возможностью сосудистой пластики. В работе

французской исследовательской группы был сконструирован сосуд с использованием эндотелиальных и гладкомышечных клеток из вены пупочного канатика. Эта конструкция была способна отвечать на присутствие эндотелинов - факторов, обуславливающих сужение просвета сосуда, что делает такие искусственные сосуды привлекательными кандидатами для испытания вазоактивных препаратов [53].

Заключение

С каждым годом растет количество различных популяций, выделяемых из клеток ПК или собственно пупочного канатика. Однако явно можно проследить три основные тенденции - попытки экспансии гемопоэтических клеток [которые обусловлены как правило малым объемом образца], попытки выделения и дифференцировки ММСК из ПК, попытки сделать все этапы процессинга максимально аутогенными [отказ от использования реактивов животного происхождения], а также осуществление первых успешных попыток использования клеток ПК в тканевой инженерии. Поэтому банкирование и отстроченное использование клеток пуповинно-плацентарного комплекса в случае необходимости будут становиться все более и более востребованными.

About the authors

V. S. Melikhova

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

A. A. Isaev

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files