A new direction for getting ESCs
- Authors: Bozo I.Y.
- Issue: Vol 2, No 4 (2007)
- Pages: 9-10
- Section: Cell technology
- URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/133663
- DOI: https://doi.org/10.23868/gc133663
- ID: 133663
Cite item
Full Text
Full Text
Эмбриональные стволовые клетки [ЭСК] являются значимым и актуальным объектом исследований в области клеточных технологий и тканевой инженерии, изучение которого вносит весомый вклад в детализацию механизмов дифференцировки и детерминации стволовых клеток в целом. В последние несколько лет исследуется явление репрограммирования, благодаря которому можно получить мультипотентные стволовые клетки из дифференцированных звеньев их дочерних дифферонов. Значительные предпосылки для этого направления сформировались благодаря достижениям в изучении регуляции работы генов, в частности, определению ряда ведущих транскрипционных факторов.
Выявлены гены Gct4 [1, 2], Sox-2 [3] и Nanog [4-6], имеющие высокий уровень экспрессии в ЭСК и играющие ключевую роль в регулировании активности структурных генов, особенно на ранних этапах дифференцировки клеток. Полагают, что данные транскрипционные факторы реализуют своё действие совместно, блокируя участки ДНК, ответственные за дифференцировку ЭСК, и активируя гены, определяющие пролиферацию и полипотентность [7]. По мере дифференцировки ЭСК уровень активности оси Cct4 - Sox-2 - Nanog снижается.
Рядом авторов описан KLF4 [Kruppel-like factor 4], который также вовлечен в репрограммирование дифференцированных клеток в плюрипотентные стволовые клетки. Показано, что данный транскрипционный фактор может функционировать как активатор - при взаимодействии с коактиваторами [рЗОО и СВР-related protein] - и как репрессор определённых генов - при связывании с корепрессорами [например, HDAC3] [8].
В онлайн версии журнала Nature в июне 2007 года были опубликованы материалы исследования М. Wernig и R. Jaenisch с соавт., в котором из фибробластов получали индуцированные iPS клетки, соответствующие по своим свойствам и потенциям ЭСК. Авторы использовали эмбриональные и взрослые мышиные фибробласты, в которых в локусы ДНК, соответствующие Cct4 и Nanog генам, чувствительным к аналогу неомицина G418 и, следовательно, находящимся в соматических клетках в «молчащем» состоянии, был встроен ген GFP и ген, продукт экспрессии которого определяет резистентность к неомицину [9]. Исследователи трансфицировали фибробласты ретровирусными векторами четырёх факторов [Gct4, Sox2, с-Мус, Klf4] с добавлением G418 на 3, 6, 9-й дни эксперимента, чтобы определить повышение активности эндогенных Gct4 и Nanog. На 20-й день с помощью G418 были отобраны 2 линии колоний, резистентных к аналогу неомицина [ОсТ4-позитивные, 0ct4 iPS, и Nanog-позитивные, Nanog iPS], при этом из меньшего количества ОсТ4-позитивных культур выход колоний, морфологически соответствующих ЭСК, был выше, что свидетельствует о большей роли экспрессии 0ct4 как критерия полипотентности. Методом ПЦР с обратной транскрипцией было показано, что уровень экспрессии суммарных [эндогенных + векторных] Gct4 и Nanog генов в репрограммированных клетках был близок к таковому в ЭСК. Характерно, что по ходу эксперимента наибольшая активность внесённых векторных генов сменялась преобладанием эндогенных генов [9].
Методами ПЦР и иммунопреципитации хроматина [chromatin immunoprecipitation] с использованием антител ктриметилированным гистонам НЗК4 и НЗК27 была доказана идентичность конфигурации хроматина у ЭСК и репрограммированных клеток. Кроме того, посредством ингибирования ДНК-метилтрансферазы исследователи показали устойчивость полученных клеток к тотальному деметилированию ДНК, что является особенностью ЭСК и утрачено дифференцированными клетками [9].
Для определения мультипотентности iPS репрограммированные клетки инъецировали в диплоидную и тетраплоидную бластоцисты, а также мышам подкожно. В результате исследователи получили жизнеспособные химеры и подкожные тератомы с полидифферонным клеточным составом. 9 из 16 эмбрионов, полученных от двух химер, были позитивны на вирусный Gct4, при этом 5 содержали ген GFP, внедрённый в Gct4. Эти данные свидетельствуют об участии репрограммированных клеток в развитии тканей эмбриона и являются косвенным доказательством соответствия их ЭСК. Кроме того, полученные клетки группировались и смешивались с ЭСК в культуре, в отличие от нативных фибробластов [9].
Идея описанного исследования не уникальна - ранее была опубликована статья К. Takahashi и S. Yamanaka [2006], в которой описан предшествующий опыт по репрограммированию фибробластов. Однако в работе 2006 года полученные iPS клетки в меньшей степени соответствовали ЭСК, так как генерировали нежизнеспособные химеры, отличались по экспрессии ряда генов и вызывали вопросы относительно стабильности полипотентного состояния [9].
Таким образом, получение мультипотентных стволовых клеток из их дифференцированных производных открывает значительные перспективы в решении вопроса о выборе источника аутогенного камбиального материала, высоко востребованного в клинической практике.
По материалам: Wernig М., Meissner A., Foreman R. et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 2007; 448:318-24
About the authors
I. Ya. Bozo
Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation
References
- Rosner М., Vigano М., Ozato К. et al. A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo. Nature. 1990; 345: 686-92.
- Scholer H. R., Dressier G.R., Balling. R. et al. Oct-4: a germline-specific transcription factor mapping to the mouse t-complex. J. Embo. 1990; 9:2185-95.
- Avilion A.A., NicolisS.K., Pevny L.H. et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on S0X2 function. Genes Dev.. 2003; 17:126-40.
- Chambers I., Colby D., Robertson M. et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 2003; 113: 643-55.
- Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell2003; 113:631-42.
- Silva J., Chambers I., Pollard S. et al. Nanog promotes transfer of pluripotency after cell fusion. Nature. 2006; 441: 997-1000.
- Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 2005; 122: 947-56.
- Evans P., Zhang W., Chen X. et al. Kruppel-like factor 4 is acetylated by p300 and regulates gene transcription via modulation of histone acetylation. J. Biol. Chem. 2007; 282: 33994-4002.
- Wernig M., Meissner A., Foreman R. et. al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007; 448: 318-24.
- TakahashiK., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126:663-76.
Supplementary files
