Our experience in harvesting, testing and storage of hematopoietic cord blood cells

Full Text

Отбор образцов пуповинной крови для заготовки

В предродовый периоду роженицы выясняют анамнез на предмет ранее переносимых трансмиссивных инфекций: вирусные гепатиты, сифилис, ВИЧ-инфекция, малярия, возвратный тиф, лептоспироз, токсоплазмоз. Обычно все женщины при поступлении в роддом уже обследованы на HBs антиген, сифилис, ВИЧ-инфекцию. При положительных тестах или указаниях в анамнезе на перенесенную одну из перечисленных инфекций заготовку крови не проводят. Кроме этого, не рекомендуется проведение сбора крови, если у матери имеет место инфекционно-септическое заболевание, в виду высокого риска инфицирования пуповинной крови. Не имеет смысла заготавливать образцы крови, если общий объем ее, полученный при эксфузии, составляет менее 40-50 мл или абсолютное содержание ядросодержащих клеток [ЯСК] менее 0,5х10³ в единице.

Из 110 обследованных нами образцов по объему не подошло 6 [объем составил от 18 до 40 мл], а по содержанию ЯСК, которых было менее 0,5х10^э в единице, не подошло 17 образцов пуповинной крови.

Заготовка и транспортировка пуповинной крови

Технология получения ПК из вены пуповины заключается в том, что кровь из плаценты по соединительным трубкам [дренажу] оттекает в контейнер с гемоконсервантом под действием силы тяжести, т.е. самопроизвольно. При этом контакт крови с окружающей средой практически отсутствует. Для эксфузии ПК используют готовые системы с мешком объемом 150 мл, в котором содержится 30 мл антикоагулянта - Davol suction evacuator [CR Bard, Cranston, RI], Можно использовать и «Гемакон» 500/300 или «Компопласт» ЗОО с 30 мл глюгицира в качестве гемоконсерванта.

Эксфузию крови осуществляют при естественных родах в родильном зале, а после кесарева сечения - в операционной или предоперационной. При естественных родах после рождения ребенка и отделения его от последа зажимом производят эксфузию крови путем пережатия пупочного канатика. Пуповинный канатик на протяжении 10-12 см в месте предполагаемой пункции тщательно обрабатывают 5% настойкой йода и 70% раствором этилового спирта или раствором АХД. После этого производят пункцию вены пуповинного канатика иглой, соединенной с «Гемаконом» 500/300 или «Компопластом». Контейнер с гемоконсервантом располагают на 50-60 см ниже уровня расположения тела роженицы, чтобы кровь самопроизвольно оттекала по соединительным трубкам в контейнер. Вся процедура эксфузии обычно длится не более 5 мин. При наступлении обескровливания плаценты соединительную трубку от контейнера перекрывают.

В случае, когда плацента уже выделена из полости матки или после кесарева сечения, ее укладывают на специальную рамку с отверстием для пуповинного канатика плодной поверхностью книзу. При отсутствии рамки сбор ПК осуществляют при помощи ассистента, который бережно держит плаценту плодной поверхностью книзу, приподняв ее на 50-70 см выше уровня расположения контейнера. Обработку и дезинфекцию поверхности пуповинного канатика, пункцию вены и дренаж осуществляют таким же способом, как описано выше. В этом случае очень важно эксфузию крови осуществлять незамедлительно. Это связано с тем, что во время операции при ручном отделении плаценты от слизистой оболочки матки нередко происходит массивное механическое повреждение маточной поверхности последа, что приводит к высвобождению и попаданию в ПК большого количества тканевого тромбопластина, который запускает механизм внутрисосудистого свертывания крови. В таких случаях пуповинная кровь может свернуться еще до начала эксфузии крови. Так, по результатам наших исследований из 42 заготовок крови из уже выделенной плаценты [после кесарева сечения] в 5 случаях не удалось получить кровь объемом более 10 мл вследствие того, что она свернулась внутри сосудов. В среднем, из 96 заготовленных доз ПК получился объем 76,5±23,7 мл [от 40 до 141 мл] при абсолютном содержании ЯСК 1,13±0,57х10⁹.

Единицы ПК доставляются из роддома в лабораторию в специальном термоконтейнере [сумке-холодильнике], который позволяет обеспечить стабильную температуру крови на уровне от +8 до +22°С на протяжении более 2 часов. С момента заготовки пуповинной крови до замораживания выделенных из нее гемопоэтических клеток не должно проходить более 24 часов. При превышении этих сроков хранения крови наблюдается значительная потеря жизнеспособности ЯСК, а при сроках более 36 часов отмечается гибель гранулоцитарных клеток с выходом в плазму крови большого количества внутриклеточных лизосомальных ферментов, которые повреждают в том числе и кроветворные клетки. В своих исследованиях мы установили, что при длительности хранения до 24 часов витальность клеток, определяемая по трипановому синему, составляла 99,0±1,0% [n=32], при хранении от 24 до 36 часов - 97,4±3,9% [n=12] и от 36 до 42 часов сохранность клеток составила 92,8±5,7% [n=6].

Получение гемопоэтических клеток

Метод сепарации пуповинной крови используется для отделения ЯСК, в том числе - гемопоэтических, от основной массы крови - эритроцитов и плазмы. Необходимость сепарации ПК с одной стороны вызвана тем, что необходимо удалить эритроциты, которые при несовместимости по групповым антигенам [ABO, Rh и др.] могут вызывать у реципиента гемолитическую реакцию. С другой стороны, при удалении плазмы и эритроцитов, уменьшается общий объем замораживаемого образца от 150-200 мл до 20-25 мл. Кроме этого, существенно снижается содержание свободного гемоглобина в компоненте после размораживания, что также уменьшает осложнения при трансфузии клеточной взвеси.

За последние два десятилетия разработано много различных методов выделения ЯСК - на градиенте плотности [фиколл, перколл, buyant density solution BDS72], с использованием седиментирующего вещества [желатина, гидроксиэтилкрахмал, метилцеллюлоза], простым центрифугированием с разделением на фракции [1, 4].

Мы провели исследования с гидроксиэтилкрахмалом [НЕЗ] и желатиной и получили вполне удовлетворительные результаты, практически не различающиеся между собой, однако, учитывая, что использовался желатин для лабораторных исследований, мы не можем рекомендовать его для седиментации образцов ПК и последующего клинического применения в качестве компонента крови. Поэтому приводим свои результаты по использованию гидроксиэтилкрахмала [HES-steril® 10%, Fresenius AG* Bad Homburg] для сепарации пуповинной крови. Длительность двукратной процедуры седиментации составила по 45 мин для каждой единицы ПК. При седиментации нами получено 83,1±9,6% ЯСК, жизнеспособность которых составляла по трипановому синему 95,5±4,3%; сохранность мононуклеарной фракции лейкоцитов была 83,4±14,1%, К0Е-ГМ-1,34±0,81 [0, 19-3, 17] хЮ³/мл и число клеток с иммунофенотипом С034⁺составило 3,53±2,37*10⁴ из каждого мл крови [n=24]. Таким образом, из отобранных единиц пуповинной крови, объем которых составлял в среднем 93,2±21,9 мл выделено 1,30±0,66x10⁹ ядросодержащих элементов, 0,44±0,15х10^э мононуклеаров, 0,93±0,91x10⁵ КОЕ-ГМ, клеток С034⁺ - 3,29±2,21х10^в.

Криоконсервирование клеток пуповинной крови

Не менее ответственным считается процесс замораживания и длительное хранение кроветворных клеток в жидком азоте или в его парах при ультранизких температурах [от -150°С до -196°С]. На эти процессы влияет ряд факторов, прежде всего - состав ограждающего раствора и скорость охлаждения клеточной взвеси. В своих работах Donaldson С. и соавт. [1996], исследуя эффективность различных концентраций диметилсульфоксида [ДМСО] - основного интрацеллюлярного криопротектера клеток [от 2,5% до 10%] в сочетании с 4% раствором HES при криоконсервировании, показали, что сохранность клеток с иммунологическим типом CD34⁺ практически не изменялась при использовании концентраций ДМСО от 5% до 10% в сочетании с HES и без него. Однако при снижении ДМСО с 5% до 2,5%, по их данным, отмечалась гибель гемопоэтических клеток ПК, сохранность которых падала с 85,4% до 12,2% [2]. Аналогичные результаты показали и Richter Е. с соавторами [1998], которые установили, что под защитой ограждающих растворов, содержащих 5% и 10% в конечной концентрации ДМСО с аутогенной сывороткой, удалось обеспечить удовлетворительную сохранность гемопоэтических клеток [3].

Вторым не менее важным для сохранения гемопоэтических клеток в функционально активном состоянии является скорость охлаждения клеточной взвеси, особенно в период фазы кристаллизации. В этот период обычно происходит большая потеря клеток. Для предотвращения гибели клеток были найдены оптимальные программы охлаждения, обеспечивающие достаточную сохранность клеточных структур. В настоящий момент общепринятым считается, что скорость охлаждения должна составлять от 1°С до 3°С в мин. Кристаллизация клеточной взвеси происходит обычно в температурном диапазоне от -3°С до -15°С. В этот период происходит выброс латентного тепла и в замораживаемой клеточной взвеси температура повышается на 1-5°С. Чтобы предотвратить повреждение клеточных мембран кристаллами льда, период кристаллизации необходимо сократить до 1,5-2 минут, что обеспечивается дополнительной подачей паров жидкого азота. В этот период разница температур замораживаемого образца и камеры программного замораживателя может составлять от 15°С до 40°С. Такой подход к решению проблемы замораживания дает большие возможности для создания простых и эффективных методов криоконсервирования.

Нами проведены исследования по криоконсервированию кроветворных клеток пуповинной крови с использованием двух видов ограждающих растворов. Основную защиту клеток обеспечивал 10% ДМСО в конечной концентрации. В первом случае использовали ДМСО и аутологичную сыворотку, во втором добавляли гидроксиэтилкрахмал [4% HES в конечной концентрации с клеточной взвесью]. Замораживание проводили в программном замораживателе ЗК 1.00.00.00 [Харьков]. Скорость охлаждения составляла 1°С/мин. Температура начала кристаллизации отмечалась на уровне -9,4±2,9°С [от -5,3°С до -13,2°С]. Выброс латентного тепла [фаза кристаллизации] длился в течение 23" - 2'40", а повышение температуры клеточной взвеси внутри проб доходило до -5,0±0,4°С [от -4,2°С до -5,7°С]. Время полной кристаллизации составляло, в среднем, 3'39"±1 '57". Разница температур камеры и опытного образца клеточной взвеси составляла 15°С. Оценку сохранности клеток проводили при помощи подсчета жизнеспособных клеток после суправитального окрашивания их трипановым синим [позволяет оценить жизнеспособность, прежде всего, зрелых клеток], число ЯСК, мононуклеарных клеток [МНК] и колониеобразующей способности гранулоцитарно-моноцитарных клеток [KDE-ГМ]. Таким образом, под защитой ограждающего раствора 10% ДМСО [в конечной концентрации] и аутологичной сыворотки [п=16] витальность клеток при суправитальном окрашивании составила 76,5±17,4%, Сохранность ЯСК и МНК, соответственно, 88,7±14,1% и 92,0±10,2%, а КОЕ-ГМ - 95,0±14,1%. Сохранность клеток при усилении ограждающего раствора 4% HES в конечной концентрации [п=1О] составила: по трипановому синему - 72,3±15,2%, ЯСК - 91,7110,6%, МНК - 92,6±18,5% и КОЕ-ГМ - 94,5±13,6%. Результаты нашего исследования достоверной разницы не выявили [Р>0,1]. Однако нами показано, что оба ограждающих раствора при программном криоконсервировании клеток являются вполне эффективными, позволяющими обеспечить удовлетворительную сохранность гемопоэтических клеток пуповинной крови.

Лабораторное тестирование пуповинной крови для использования ее в клинической медицине

Использование ПК и ее компонентов, прежде всего, гемопоэтических клеток, в клинической практике требует ее лабораторного тестирования на выявление бактериального загрязнения, вирусного и паразитарного персистирования, а также HLA типирования и исследования на содержание гемопоэтических предшественников [5].

Следуя Европейским стандартам безопасности приготовления и использования компонентов крови [7-я редакция, 2001 г.], каждый образец ПК тестируется на групповую принадлежность крови по АВО и Rh[D], проводится HLA- типирование, определение АлАТ, исследуется на наличие HBs антигена, антител к вирусному гепатиту С и цитомегаловирусной инфекции [ЦМВ], сифилису, Т-клеточному лейкозу человека [HTLV], а также определяют жизнеспособность лейкоцитов [6]. Кроме этого, осуществляют бактериологический посев на стерильность. Для более достоверной диагностики ВИЧ-инфекции и ЦМВ предлагают постановку полимеразной цепной реакции [ПЦР].

Для полного лабораторного тестирования ПК необходимо около 10 мл крови: вышеперечисленные исследования требуют до 4 мл крови, а оставшиеся 6 мл центрифугируют. Полученную плазму замораживают и хранят в холодильниках при -40°С или ниже, а мононуклеарные клетки выделяют в градиенте плотности [фиколл], криоконсервируют и в последующем используют для дальнейшего тестирования [постановка ПЦР на ЦМВ, ВИЧ, повторное определение HLA генотипа]. Замороженные МНК хранят в двух пробирках в отдельных биологических хранилищах в жидком азоте или его парах. Ниже приводится подробная таблица лабораторных тестов пуповинной крови до и после криоконсервирования, принятых в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии.

При отрицательных тестах по вышеперечисленным параметрам ПК можно использовать в клинике. Исследования клеток после их размораживания необходимы для оценки качества трансплантата, прогнозирования времени приживления кроветворных клеток и восстановления гемопоэза у реципиента.

 

Таблица. Лабораторное тестирование пуповинной крови

Изучаемые показатели	После заготовки	После сепарации	После размораживания
Объем пуповинной крови	+	+	+
Количество ЯСК	+	+	+
Количество МНК	+	+	+
Количество КОЕ-ГМ		+	+
Количество CD34+	±	+	+
Содержание эритроцитов	+
Примесь свободного гемоглобина	+	+	+
Жизнеспособность
ЯСК	+	+	+
АлАТ	+
АсАТ	+
Билирубин	+
Бактериальное загрязнение	+		+
HBs Ад	+
Антитела к вирусному гепатиту С	+
Антитела к бледной трепонеме	+
Антитела к ВИЧ	+		+ (ПЦР)
Антитела к ЦМВ	+		+ (ПЦР)
Антитела к токсоплазмозу	+
Антитела к HTLV -I и -II	+		±
HLA- фенотип (I класса)	+
HLA- генотип (II класса)	±	+

 

About the authors

K. M. Abdulkadyrov

Federal State University Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology of the Ministry of Health and Social Development

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg

N. A. Romanenko

Federal State University Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology of the Ministry of Health and Social Development

Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg

E. A. Selivanov

Federal State University Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology of the Ministry of Health and Social Development

Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg

References

Supplementary files