Sozdanie kletochnoy platformy dlya issledovaniya mekhanizmov neyrodegeneratsii s pomoshch'yu geneticheski-kodiruemykh biosensorov

Abstract

Full Text

Увеличение средней продолжительности жизни привело к тому, что заболевания нейродегенеративной группы стали встречаться чаще. Их основная особенность - неуклонная гибель клеток нервной системы, которая, в свою очередь, приводит к утрате специфических функций: когнитивных и двигательных. Несмотря на большое количество исследований, проведенных за последние годы, не были раскрыты точные механизмы развития нейродегенеративных заболеваний, так же как и не было разработано эффективных препаратов, способных отменить или замедлить развитие патологии. Несмотря на то, что клинически, каждое нейродегенеративное заболевание имеет свои специфические симптомы, на молекулярном уровне, они все обладают схожими паттернами патологических процессов, которые приводят к гибели нейронов. Развитие технологий получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), редактирования генома с помощью CRISPR/Cas9 и направленной дифференцировки in vitro привело к появлению новой тенденции в биомедицине: моделированию заболеваний на линиях ИПСК. Одним из способов исследования интересующих процессов на подобной модели являются ге-нетически-кодируемые биосенсоры, которые позволяют в режиме реального времени регистрировать молекулы-мессенджеры, метаболиты и активность ферментов. В данной работе была разработана платформа на основе стволовых клеток, предназначенная для исследования клеточных процессов, вовлеченных в нейродегенерацию: окислительный стресс, апоптоз и стресс эндоплазматического ретикулума. Был создан набор плазмидных донорных векторов для CRISPR-опосредованной встройки последовательностей биосенсоров в геном. Применение системы CRISPR/Cas9 в данном случае позволило произвести направленную встройку данных последовательностей в так называемый «safe-harbor» локус AAVS1 и избежать негативных последствий случайных интеграций последовательностей. Кроме того, из мононуклеаров периферической крови больного БАС были получены ИПСК. На их основе, используя CRISPR/Cas9 в форме рибо-нуклеопротеиновых комплексов и донорные плазмиды, было получено 5 трансгенных линий ИПСК со встройкой последовательностей разных биосенсоров под контролем доксициклин-зависимого промотора. То же самое было сделано на основе условно-здоровой контрольной линии ИПСК. Было показано, что элементы биосенсоров функционально активны и способны продуцировать флуоресцентный сигнал в ответ на специфические стимулы.