MyoD-indutsirovannaya transdifferentsirovka dermal'nykh fibroblastov s mutatsiey v gene DYSF, rassmatrivaemaya kak test-sistema dlya skrininga preparatov disferlinopatii

Full Text

Дисферлинопатии возникают в связи с мутациями в гене DYSF, которые вызывают дефицит дисферлина в сарколемме. Воспалительная клеточная инфильтрация может быть характерной чертой дисферлинопатии, группы мышечных дистрофий, наследуемых по аутосомно-рецессивному типу. В первую очередь при данном заболевании поражаются мышцы конечностей, бедер и плеч, что приводит к прогрессирующему нарушению ходьбы. Эффективного лечения для этих заболеваний пока нет. Поиск подхода генной терапии мышечных дистрофий требует соответствующей модели заболевания in vitro. Поскольку получение биопсии мышц от пациентов с таким орфанным заболеванием для выделения и культивирования клеток в лаборатории достаточно затруднительно или вообще невозможно, нами была разработана тест-система на основе дермальных фибробластов пациента с дисферлинопатией. В нашем исследовании мы взяли дермальные фибробласты, выделенные из дермальной ткани пациента с дисферлинопатией (мутация в гене DYSF, экзон 26). Фибробласты пациента были иммор-тализованы. Используя наработанный лентивирус LV-TRE-VP64-human-MyoD-T2A-dsRedExpress2 с тетраци-клин-индуцибельным промотором (Tet-ON) клетки были генетически модифицированы и отселектированы для осуществления миогенной дифференцировки. В результате, после получения чистой популяции клеток и индукции экспрессии генов доксициклином с использованием инвертированного микроскопа AxioOberver.Z1 наблюдали слияние клеток и образование миофибриллярных структур. Для анализа эффективности миогенной диф-ференцировки был проведен Вестерн-блоттинг, который выявил положительную реакцию с моноклональными антителами к белку MyoD (sc-377460), размер бэнда соответствовал ожидаемому размеру белка MyoD (45 кДа). Затем, с целью анализа присутствия мРНК дисферлина в модифицированных миобластах была проведена ПЦР в реальном времени, которая выявила небольшую экспрессию дисферлина в экспериментальных образцах. Полученную MyoD-индуцированную клеточную линию ми-областов можно использовать в качестве тест-системы для новых подходов к терапии дисферлинопатий.

About the authors

Irina Georgievna Starostina

Dar'ya Sergeevna Chulpanova

Alisa Almazovna Shaymardanova

Valeriya Vladimirovna Solov'eva

Ivan Antonovich Yakovlev

Roman Vadimovich Deev

Artur Aleksandrovich Isaev

Al'bert Anatol'evich Rizvanov

References

Supplementary files