Poluchenie uluchshennogo varianta vektora dlya gennoy terapii Kh-stseplennoy adrenoleykodistrofii

Abstract

Full Text

Х-сцепленная адренолейкодистрофия - это неизлечимое моногенное заболевание, при котором поражается нервная система, а также наблюдается надпочечниковая недостаточность. Эффективным лекарственным препаратом может стать вектор, способный обеспечить экспрессию функциональной копии поврежденного гена. Для доставки терапевтических генов в организм человека все шире используются векторы на основе адено-ассоциированных вирусов (ААВ). Однако их применение часто ограничено низким уровнем тропности вируса к тканям-мишеням. Наша цель - получить новый вариант ААВ с повышенной тропностью к целевым тканям (головной и спинной мозг, надпочечники) с помощью направленной эволюции вируса in vivo. Такой подход включает в себя получение библиотеки мутантных генов капсида ААВ (Cap), т. к. именно белки капсида отвечают за тропность, с последующей in vivo селекцией через системную доставку библиотеки вирусных частиц взрослым мышам. Результаты. Создана библиотека случайных мутантов на основе капсида ААВ серотипа 9 (ААВ9). Методом ПЦР с ошибками проведен случайный мутагенез гена Cap9, продукт амплификации клонирован в pSub2 вектор, содержащий cis-элементы, необходимые для репликации, упаковки и интеграции вируса. Параллельно отработан протокол наработки вирусных частиц и изучено биораспределение ААВ9 при системном введении мышам линии C57BL/6. Для этой задачи мы использовали ААВ вектор, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP). Сборку вирусных частиц проводили с использованием trans-плазмиды, содержащей ген Cap9, и аденовирусной хелперной плазмиды. Через 16 дней после введения вируса был проведен забор органов и выделена геномная ДНК. Эффективность вирусной трансдукции различных тканей оценивали по уровню экспрессии в них репортерного гена GFP. В результате ПЦР-анализа было показано, что серотип 9 обладает высокой тропностью к мышцам, сердцу, печени и легким, что согласуется с данными литературы. Кроме того, мы обнаружили достаточно высокую экспрессию GFP в надпочечниках. Однако, эффективной трансдукции клеток головного и спинного мозга не наблюдалось, несмотря на то, что ААВ9 способен преодолевать гематоэнцефалический барьер и рекомендован для генной терапии ЦНС. Полученные нами данные подтверждают необходимость поиска улучшенного варианта вирусного капсида, на основе которого в дальнейшем может быть разработан геннотерапевтический препарат для лечения Х-сцепленной адренолейкодистрофии.