Amyotrophic lateral sclerosis: characteristics of the immunophenotype of hematopoietic precursor cells as a potential biomarker for early diagnostics of fatal disease

Full Text

Введение К нейродегенеративным болезням (НДБ) человека относят большую группу неизлечимых нервных болезней, таких как болезнь Альцгеймера [1, 2], болезнь Пика, болезнь Паркинсона, системные корковые и мозжечковые атрофии, корково-базальная дегенерация, фронтотемпоральная деменция, оливопонтоце-ребеллярная дегенерация и еще целый ряд нервных заболеваний [3-5]. В настоящее время основные причины и патогенез многих НДБ человека остаются неизвестными [1-3, 6]. Считается, что в основе большинства НДБ лежат генетические, протеомные и дис-метаболические изменения в нейронах головного мозга и спинного мозга, приводящие к дегенерации нейронов разных типов из-за накопления патоспецифических белков в различных компартментах этих клеток [6]. При болезни Альцгеймера, прогрессирующем надъядерном параличе, кортико-базальной дегенерации в нейронах головного мозга накапливаются tau-белки (таутопа-тии) [1, 2], при болезни Паркинсона, множественной системной атрофии, деменции с телами Леви - тельца Леви (синуклеопатии) [3], при дегенерации фронтотемпоральных долей - FUS белки (фузопатии) [3] и т. д. Последние десятилетия к нейродегенеративным заболеваниям стали относить боковой амиотрофический склероз (БАС) или болезнь Лу Герига [3, 4, 7]. Другое современное название БАС - болезнь моторного нейрона [8-11]. Общеизвестно, что при БАС, как и при всех НДБ, всегда выявляется определенный генетический и протеомный дефект моторных нейронов [5, 7, 9, 11-13]. В настоящее время при БАС определены генетические изменения в 106 генах, вовлеченных в патологический нейродегенеративный процесс, и показана особая роль мутаций SOD-1, FUS и TDP-43 [14] в формировании протеомных нарушений в цитоплазме и ядре мотонейронов при моделировании БАС на животных и у человека с БАС [10-13, 15-20]. В последней международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ-10) БАС официально отнесен к группе нейроде-генеративных заболеваний и обозначен исключительно как болезнь моторного нейрона. Неврологами всего мира БАС считается болезнью моторного нейрона [11, 14, 15]. Группа заболеваний БАС признана фатальным заболеванием центральной нервной системы, которое сопровождается массивной нейродегенерацией моторных нейронов, спастико-атрофическим синдромом с последующей гипотрофией и атрофией мышц [7, 21]. В мире не существует эффективного лечения и возможности предотвращения быстрого летального исхода при БАС [7-9, 22]. Время жизни большинства пациентов с установленным диагнозом БАС составляет 2-3 года, 10-15% больных живут от 5 до 10 лет [13, 23, 24] и лишь единицы - более 10 лет. До настоящего времени диагностика этого фатального заболевания была и остается «приговором без права на помилование». У подавляющей части пациентов с БАС клинически болезнь манифестирует только тогда, когда заболевание уже зашло в самую последнюю финальную стадию необратимого патологического процесса и прошло «точку невозврата». Диагноз БАС устанавливают только клинически и по данным электронейромиографии (ЭНМГ), когда у пациента погибло более 80% мотонейронов в головном и спинном мозге и спасти больного с диагностированным БАС не возможно, так как у него остались не поврежденными лишь 10-15% мотонейронов нервной ткани [10, 25]. Ранней молекулярно-биологической диагностики и реального лечения при БАС нет [26, 27]. Роль иммунной системы в развитии почти всех форм БАС неоднозначна и во многом негативна [28, 29]. Очевидно, что во всех случаях этих смертельных заболеваний имеет место крайне избирательная (селективная) функциональная недостаточность иммунной системы, которая играет важную роль в патогенезе и патоморфологии заболевания. Недостаточность иммунной системы при БАС исследователями отмечалась неоднократно [27]. Несмотря на то, что долгое время заболевание признавали аутоиммунным, существенных количественных изменений клеточного и гуморального иммунитета при БАС выявлено не было. Более того, в последние годы аутоиммунный генез БАС неврологи стали считать научно не обоснованным. Главный аргумент в пользу отрицания аутоиммунного генеза болезни заключался в том, что при БАС нет положительного результата от применения стандартной терапии, высоко эффективной при других аутоиммунных заболеваниях: 1 ) нет достижения ремиссии болезни при введении глюкокортикоидных гормонов; 2) нет эффекта от аутогенной трансплантации костного мозга (ТКМ), как при рассеянном склерозе и других аутоиммунных болезнях соединительной ткани; 3) нет эффекта от плазмафереза; 4) нет результата от применения блокаторов интерлейкинов и других препаратов, направленных на уменьшение системного воспаления и деструкции ткани [4, 5, 12, 28]. Клинические и лабораторные критерии, на которых основано отрицание аутоиммунного генеза БАС, нам показались не убедительными, так как морфологические изменения в нервной ткани при БАС очевидно свидетельствуют в пользу системного асептического воспаления, приводящего к проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и возникновению механизмов первичных и вторичных аутоиммунных нарушений, связанных с повреждением нейронов и антигенной презентацией на дендритных клетках недоступных антигенов этих нейронов. Патологическая проницаемость ГЭБ приводит к дополнительной массивной лейкоцитарной инфильтрации нервной ткани, формированию локального воспаления, аутореактивности собственных лимфоцитов и цитотоксической дегенерации нервной ткани. Несмотря на то, что заболевание имеет в своей основе доказанный генетический дефект [30, 31] и статистически доказанные достоверные транскриптомные и протеомные нарушения в моторных нейронах, наши исследования этиопатогенеза и исходов БАС позволили нам предположить, что болезнь мотонейрона это не причина, а следствие «истинного» патологического мультисистемного аутоиммунного процесса, и в основе молекулярно-биологического дефекта мотонейронов лежит изначально протеомное перерождение гемопоэтической стволовой клетки (ГСК), как родоначальницы всех клеток системы кроветворения и иммунитета [32]. Была выдвинута гипотеза, что БАС это «облигатное» или «истинное» аутоиммунное заболевание, связанное с системной аутореактивностью, обусловленной протеом-модифицированной ГСК и гемопоэтических прогениторов и, соответственно, всех их потомков, а рассеянный склероз и другие аутоиммунные заболевания могут быть как «факультативными» или «локальными» аутоиммунными заболеваниями, связанными с аллореактивностью только периферических иммунокомпетентных клеток крови (ИКК) при здоровой ГСК, так и иметь «облигатные» или фундаментальные причины формирования терапевтически не курабельного прогредиентно-рецидивирующего заболевания, также связанного с геномно-эпигеномным повреждением ГСК. Именно при таких формах рассеянного склероза с патологией ГСК абсолютно не эффективна аутогенная ТКМ. Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 74 оригинальные исследования Важно отметить, что ГОК или стволовые кроветворные клетки - очень малочисленная, но гетерогенная клеточная популяция, объединяющая в себе несколько типов (субпопуляций) клеток, отличающихся по уровню дифференцировки и способности к пролиферации [33, 34]. Среди них присутствуют как недифференцированные, практически не делящиеся стволовые клетки (СК), так и коммитированные (ограниченные в направлении дифференцировки) клетки-предшественницы [34]. Концентрация ГСК в периферической крови в состоянии стабильного кроветворения мала - менее 0,01%, что делает затруднительным их изучение даже самыми чувствительными методами [35]. Но именно ГСК имеют самый длительный клеточный цикл среди всех клеток организма человека (360 сут.), являются основной регуляторной и управляющей системой в существующей иерархии всех клеточных систем организма, первыми реагируют на мутации генов в клетках и появление асептического воспаления при патологии тканей, мигрируют в зоны воспаления из костного мозга, адгезируют к патологическим клеткам и «направляют их развитие» в сторону дифференцировки или апоптоза по принципу «эффекта свидетеля» (by stander effect) [13, 36]. В нашей работе 201 6 г. на примере злокачественных опухолей мы описали инструмент регуляции функций ГСК в зоне воспаления, который, по нашему мнению, представляет собой универсальный механизм горизонтального и вертикального микровезикулярного информационного обмена цитоплазматическими белками с патологическими клетками [37]. В зависимости от мутационного повреждения клеток-мишеней в тканях, содержащих мутантные клетки, в ГСК происходят геномно-протеом-ные перестройки и патологические модификации белков в цитоплазме, ядре и на поверхности мембран [37]. Мы предположили, что в результате межклеточного обмена при БАС появляются протеом-модифицирован-ные аутоГСК, получившие иммунизацию иммуноспеци-фическими патологическими белками, что ранее было нами показано в фундаментальных исследованиях по протеомике СК [38]. Была высказана гипотеза, что в случаях с БАС формируются мутантные протеом-моди-фицированные ГСК, производящие аутоагрессивных к собственной нервной ткани потомков - аутореактивные ИКК, что было подтверждено экспериментальными результатами протеомного картирования и профилирования молекулярной структуры ГСК при БАС [13, 27]. Под воздействием этиопатогенетических факторов заболевания формируется специфический протеомный профиль ГСК, меняющий нормальный фенотип ГСК на патологический. Целью настоящего исследования стало прицельное сравнительное картирование, профилирование и изучение протеомных маркеров клеточной поверхности аутогенных ГСК при БАС и здоровых доноров для выявления уникальных молекулярных характеристик их фенотипа и особенностей иммуноспецифического протеомного ландшафта клеточной поверхности ГСК, которые могут стать фундаментальными молекулярно-биологическими маркерами формирования патоспецифической недостаточности иммунной системы и обеспечить надежные критерии для проведения ранней диагностики этого неизлечимого заболевания. Материал и методы Исследование субпопуляций ГСК было проведено на 147 образцах лейкоконцентрата периферической крови (ЛК ПК): 61 образец от 54 здоровых доноров костного мозга и 86 образцов от 62 пациентов с БАС после подписания информированного согласия. До забора крови проводили мобилизацию ГСК в ПК с применением гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) (Нейпоген, Амджен Европа Б.В., Нидерланды), затем из образцов крови выделяли мобилизованные мононуклеары ПК (ЛК) по стандартной процедуре лейко-цитофереза на сепараторе крови (Baxter, Cobe Spectra, США). Для анализа брали 2-3 мл ЛК свежеполученной ПК или такое же количество ЛК после криоконсервации и длительного хранения в криобанке ФГБУ НМИНЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Все больные БАС наблюдались в отделениях клиники «НейроВита» в течение 2002-2018 гг.: 60 (96,7%) больных БАС получали клеточную терапию аутогенными ГСК и 2 пациента (3,2%) с БАС - аллогенными гаплоидентичными ГСК из ЛК. Анализ поверхностных антигенов ГСК проводили после 3-сут. стимуляции Г-КСФ и забора 10 мл ПК. Среди здоровых доноров костного мозга было 35 (64,81%) мужчин и 19 (35,2%) женщин. Средний вес мужчин составил 86,2 кг, средний вес женщин - 61,6 кг; средний возраст доноров - 37,6 г. (диапазон 26-44 г.). Среди пациентов с БАС доминировали мужчины (47 человек, 75,8%) над женщинами (15 человек, 24,2%). Средний вес пациентов с БАС составил 74,2 кг у мужчин и 56,3 кг у женщин; средний возраст пациентов с БАС равнялся 56 г. (медиана 54,3 г., диапазон 42-68 г.). По этиопатогенетической классификации у 6 (9,7%) пациентов БАС был представлен семейным вариантом (у 2 пациентов была диагностирована аутосомно-доми-нантная форма БАС, ассоциированная с мутацией SOD- 1, у 1 пациента - без мутации SOD-1, у 3 пациентов был выявлен аутосомно-рецессивный семейный БАС, ассоциированный с мутацией SOD-1), а у 56 (90,3%) - спорадическим. Исходя из классификации по клинической картине среди пациентов с семейным БАС в 3 случаях была диагностирована бульбарная форма БАС, в 1 - высокая (церебральная), в 1 - шейно-грудная и в 1 пояснично-крестцовая; среди пациентов со спорадическим БАС - 6 больных БАС имели высокую (церебральную) форму, 16 - бульбарную форму, 7 - шейно-грудную форму, 33 - пояснично-крестцовую форму. Одна пациентка с семейным БАС за период наблюдения была переведена на аппарат ИВЛ, и, находясь на аппаратном дыхании, в течение 2 лет продолжила свое пребывание в исследовательской группе. Стимуляцию Г-КСФ все пациенты с БАС, несмотря на тяжесть состояния, перенесли удовлетворительно. Мембранный иммунофенотип ГСК оценивали с использованием многопараметровой проточной цитометрии (FACScan, Becton Dickinson, США) по мембранным антигенам (белковым маркерам мембранной поверхности, БММП) CD38, CD71, CD90, CD56, CD19, CD61,CD 117, СD10 и др. во фракции CD34+-клеток (табл. 1 ), профилировали уровень экспрессии основных маркеров клеточной поверхности различных субпопуляций ГСК, анализировали специфические молекулярно-биологические изменения полученного профиля и трактовали выявленные нарушения БММП ГСК, как нейроспецифический профиль молекулярного ландшафта клеточной поверхности ГСК при БАС. Статистический анализ полученных данных проведен в программе SPSS версия 17 для Windows. При обработке материала использованы: функция частот для описания последовательных рядов переменных, средних значений, медианы, стандартной ошибки средних значений и вариабельности значений переменных; функция бивариантных корреляций для определения Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 75 Таблица 1. Характеристика антигенов и моноклональных антител для определения экспрессии маркеров мембранной поверхности ГСК Антиген (кластер дифференцировки) Клон/класс Производитель Gp105-120 (CD34) HPCA-2/8G12/IgG1, к Becton Dickinson, США Leukocyte common antigen (CD45) Hl30/IgG1, к Becton Dickinson, США ICAM-3 (CD50) TU41/IgG2b, к Immunotech, Coulter, Франция HLA-DR L243IgG2a, к Coulter, Франция Becton Dickinson, США CD38 H_T2, HB7/IgG1, к Becton Dickinson, США Thy-1 (CD90) 5E10/IgG1, к Immunotech, Coulter, Франция c-kit (CD117) YB5.B8/IgGr к Becton Dickinson, США N-CAM (CD56) B159/IgG1, к Becton Dickinson, США Transferrin receptor CD71 M-A712/IgG2a, к Coulter, Франция Becton Dickinson, США CD13 _138/IgG1, к Becton Dickinson, США CD33 P67.6/IgG1, к Becton Dickinson, США Coulter, Франция Integrinp3 chain (CD61) RUU-P_7F12/IgG Becton Dickinson, США CD19 4G7 Coulter, Франция CD7 M-T701/IgG1, к Immunotech, Coulter, Франция CD57 HNK-1/IgM Becton Dickinson, США LFA-2 RPA-2.10/IgG1 Becton Dickinson, США CD10 HI10a/IgG2a Becton Dickinson, США Glycophorin A (CD236а) GA-R2 (HIR2)/IgG2b, к Immunotech, Coulter, Франция СD28 CD28.2/IgG1, к Becton Dickinson, США CD300 UP-D1/IgG1, к Becton Dickinson, США CD11b ICRF44/IgG1, к Becton Dickinson, США CD123 9F5/IgG1, к Becton Dickinson, США CD185 RF8B2/IgG2b, к Becton Dickinson, США CD2 RPA-2.10/IgG1, к Becton Dickinson, США CD81 JS-81/IgG1, к Becton Dickinson, США коэффициента корреляции двух независимых переменных (корреляция достоверна при р< 0,05); функции сравнения средних значений независимых и зависимых переменных (доверительный интервал - 95%); функция кодирования переменных в соответствии с интервалами значений выбранной переменной. Результаты В 147 образцах мононуклеарной фракции стимулированной ПК определяли экспрессию мембранных антигенов, ассоциированных с ГСК различного уровня дифференцировки. Данные по среднему количеству изученных субпопуляций ГСК представлены в табл. 2. и в виде диаграммы (рис. 1 ), которые наглядно иллюстрируют статистическую достоверность изменения про-теомного состава мембранных белков ГСК пациентов с БАС относительно здоровых доноров. Установлены отличия в субпопуляционном составе мобилизованных ГСК здоровых доноров и больных БАС, за исключением Н1_А^П+-ГСК, количество которых было приблизительно одинаковым как у больных, так и у доноров (табл. 2). Анализ субпопуляционного состава мобилизованных ГСК доноров и больных БАС на диаграмме (рис. 1) выявил несколько критичных отличий субпопуляционного Рис. 1. Усредненный протеомный профиль маркеров клеточной поверхности гемопоэтических стволовых клеток у здоровых доноров (n=54, красный, норма) и больных БАС (n=62, синий) состава ГСК здоровых доноров и больных БАС. У всех больных БАС на поверхности клеточных мембран ГСК была резко снижена экспрессия белковых маркеров CD38, СD33, CD117 и CD71; отмечена незначительная экспрессия маркеров СD56, CD28, CD300, CD1 85 и зарегистрировано повышение экспрессии маркеров CD61, CD2, и CD81. Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 76 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таблица 2. Субпопуляции CD34+-клеток (процент АГ+ клеток в пределах суммарного пула ГСК) у больных БАС и здоровых доноров Антиген (АГ) Группа Среднее± ст. ошибка Медиана Разброс Кол-во больных (n) Р CD45 БАС 89,20±1,40 87,5 80,3-100,0 62 Доноры 70,40±3,40 77,9 1,5-100,0 54 0,0500 HLA-DR БАС 95,10±0,31 95,0 85,7-98,0 62 Доноры 92,90±1,10 94,0 74,4-99,9 29 0,0010 CD38 БАС 20,10±2,63 20,0 14,5-26,0 62 Доноры 65,00±4,60 71,5 22,2-97,6 32 0,0010 CD33 БАС 24,30±3,05 25,0 13,6-44,8 62 Доноры 67,60±4,70 75,5 7,1-99,0 24 0,0001 CD13 БАС 78,70±1,97 78,1 1,0-100,0 20 Доноры 90,30±1,90 92,4 50,0-99,5 28 0,0090 CD71 БАС 16,10±1,12 16,0 10,6-44,3 18 Доноры 78,70±4,90 88,9 9,8-98,4 25 0,0001 CD117 БАС 69,00±3,35 24,1 13,1-97,5 20 Доноры 79,60±3,90 82,4 48,4-97,5 16 0,0030 CD90 БАС 26,40±3,26 24,0 0,1-49,5 20 (Thy-1) Доноры 41,90±6,80 28,4 0,4-92,4 26 0,0200 CD50 БАС 98,10±0,34 99,0 84,9-100,0 15 Доноры 98,10±0,60 96,9 92,4-100,0 18 0,0010 CD56 БАС 0,60±1,09 0,6 0,0-5,0 25 Доноры 28,70±12,80 5,4 0-92,6 9 0,0100 CD19 БАС 3,01±0,56 2,5 0,4-6,2 16 Доноры 15,40±4,40 6,3 0,0-86,1 26 0,0100 CD61 БАС 2,47±0,30 24,5 0,0-40,3 16 Доноры 10,60±2,30 6,4 2,7-28,0 13 0,0050 CD7 БАС 1,50±0,40 2,3 0,0-4,0 25 Доноры 11,20±3,80 4,5 0-98,1 28 0,0500 При профилировании маркеров белков мембранной поверхности ГСК в случаях семейного БАС у всех больных были отмечены иммуноспецифические особенности антигенов поверхности ГСК, но отличия между больным БАС и здоровыми родственниками были, как правило, минимальными (рис. 2). Из рис. 2А видно, что, несмотря на расхождения по ряду антигенов, общая тенденция профиля БММП ГСК здоровой сестры больной БАС на ИВЛ по показателям Cd1 17+CD33+CD28+CD300+CD11b +CD123+ напоминает профиль БММП ГСК больной БАС и отличается только количественными параметрами. Однако при семейном БАС различия в количестве CD38+ предшественников были существенными: экспрессия CD38+у больной БАС была снижена в 3-4 раза по сравнению со здоровыми донорами, а у здорового родственника больной экспрессия данного антигена была близка к норме (рис. 2). Популяция ГСК, преобладающая у здоровых доноров, характеризует моноцитарную направленность дифференцировки клеток-предшественниц. На рис. 2Б видны протеомные изменения ГСК у здорового брата 45 лет больной С., аналогичные изменению профиля БММП ГСК больной БАС с небольшими расхождениями по антигенам ГСК. Профиль антигенов ГСК здоровых и больных членов семьи носителей БАС носит схожий характер и у здоровых членов семьи носителей БАС очень напоминает общий иммунофенотипический профиль БММП ГСК всех больных бАс. При анализе иммунофенотипического профиля ГСК больных спорадическим БАС с разными формами заболевания (высокой, бульбарной, пояснично-крестцовой) были получены отчетливые иммуноспецифи-ческие изменения протеомного профиля антигенов клеточной поверхности ГСК, характерные для БАС в целом, но не специфичные для формы болезни (рис. 3). У больных со спорадическим БАС общая тенденция профиля БММП ГСК была близка к профилям больных с семейным вариантом и профилям их родственников по антигенам CD117+CD33+CD28+CD300+CD11b +CD123+ и отличалась от профилей здоровых доноров, не являющихся родственниками больных БАС (рис. 2, 3). таким образом, имеются реальные предпосылки для возможности молекулярно-биологической диагностики БАС до появления первых клинических признаков: по диаграмме иммунофенотипического профиля ГСК можно диагностировать заболевание задолго до того, как появится клиническая и нейрофизиологическая манифестация болезни у больного семейным и спорадическим БАС. Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 77 120,0 Рис. 2. Иммунофенотический профиль белковых мембранных маркеров гемопоэтических стволовых клеток при семейном БАС: А - больная БАС на ИВЛ (красный), здоровая старшая сестра больной БАС на ИВЛ (синий), здоровые доноры (n=54, зеленый, норма); Б - больная С. с бульбарной формой БАС (сиреневый), здоровый брат больной С. (синий), усредненные показатели пациентов с БАС (n=62, красный), здоровые доноры (n=54, зеленый) Обсуждение Нами были проведены многолетние исследования поверхностных антигенов ГСК и гемопоэтических про-гениторов у небольшого количества больных с БАС, которые, однако, позволяют исключить ошибку малых чисел, сделать верные и статистические обоснованные выводы. Ранее мы показали в эксперименте, что изменения в геноме ГСК приводят к изменениям про-теомной структуры клетки на уровне белков клеточной мембраны, цитоплазматических и ядерных белков [37, 38]. Протеомное картирование ГСК и профилирование их белков мы осуществляли классической масс-спектрометрией ГСК. Такой анализ для выявления всего спектра патоспецифических изменений в клетках является дорогостоящим и длительным, используется только в поисковых научно-исследовательских работах, практически не может широко применяться в клинике и быть рабочим инструментом ранней диагностики БАС, поэтому нужна простая и достаточно надежная система молекулярно-биологических маркеров ранней диагностики. Предложенная нами ранняя диагностика БАС основана на патоспецифических протеомных изменениях (модификации) профиля экспрессии БММП ГСК у больных с БАС, как самого раннего объективного признака возникновения несостоятельности (недостаточности) иммунной системы, которые и могут стать основными маркерами раннего диагностирования болезни. Доказательством этого научного факта стали статистически достоверные данные настоящего исследования о нейроспецифической модификации протеомного иммунофенотипического профиля мембранной поверхности ГСК у пациентов, которые позволили провести сравнительный анализ результатов исследования экспрессии мембранных белков ГСК у больных с нейроде-генеративными заболеваниями и здоровых доноров. На основании полученных данных были определены фундаментальные различия между экспрессией маркеров клеточной поверхности ГСК больных БАС и здоровых людей (доноров), не имеющих клинических и лабораторных признаков заболевания. В наших предыдущих работах мы описали механизм межклеточного обмена между мутантными опухолевыми клетками и ГСК [37-39]. Полагаем, что на опухолях нами был выявлен уникальный системный информационнокоммутационный молекулярно-биологический механизм межклеточного взаимодействия ГСК с тканеспецифичными системами мутировавших клеток, который является универсальным инструментом информационного межклеточного обмена и в полной мере может отражать рис. 3. Иммунофенотический профиль при спорадическом БАС: больная З. с высокой (центральной) формой (синий), больной С. с пояснично-крестцовой формой (красный), больная С. с бульбарной формой (сиреневый), брат больной С. без клинических проявлений (голубой), усредненный иммунофенотипический профиль при БАС (оранжевый) и в норме (зеленый) процесс информационных межклеточных взаимодействий при БАС, где ГСК с мутацией SOD-1 встречается с клетками нервной ткани в зоне повреждения ГЭБ, и все процессы происходящего межклеточного обмена идентичны процессам при онкологическом заболевании [37-39]. Но, любая мутация в геноме ГСК приводит к появлению иммуноспецифичных транскриптомных и протеомных нарушений в картированном белковом профиле клетки и будет обязательно отражена на протеомном ландшафте мембраны ГСК и при БАС. Действительно, мы обнаружили на мембранной поверхности ГСК у больных с БАС очень специфичный иммунофенотипический профиль молекулярных белков мембранной поверхности ГСК, отличающийся по маркерам мембранной поверхности ГСК от здоровых доноров и названный нами как нейроспецифический, а недостаточность иммунной системы при БАС мы обозначили как нейродегенеративную недостаточность иммунной системы. Принципиальным в отношении изучения субпопуляций ГСК при БАС с клинической точки зрения является вопрос, насколько вклад каждой из субпопуляций ГСК определяет эффект нейроспецифической модификации ГСК в целом и участвует в формировании аутореактивности ГСК и ее потомков. Преобладание той или иной субпопуляции может оказаться существенным в отношении ранней диагностики различных форм БАС, и это надо изучать дополнительно. Гены & Клетки Том XIV, № 1, 2019 78 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Не вызывает сомнения, что представленные нами экспериментальные данные о возможной ранней диагностике БАС на основе изучения ландшафта маркеров клеточной поверхности требуют дальнейшего уточнения и глубокого фундаментального анализа. Но уже сегодня эти исследования демонстрируют реальную возможность ранней диагностики БАС и позволяют прогнозировать возможность развития болезни у членов семьи больных, несущих в своих ГСК протеомные изменения молекулярной клеточной структуры, без проведения дорогостоящих генетических исследований типа геноти-пирования. Очевидно, что накопление в ГСК у пациентов с семейным вариантом заболевания патологических белков, обусловленных SOD-1 или Fus мутациями мотонейронов, приводит к углублению протеомных отличий маркеров клеточной поверхности ГСК, и цитофлюори-метрический анализ маркеров этих клеток позволит на самых ранних этапах болезни диагностировать начавшийся процесс дегенерации в моторных нейронах еще до начала манифестации болезни специфическими клиническими нарушениями и станет верифицироваться, как повреждение мотонейронов в спинном или головном мозге человека-носителя этой патологической мутации. Нам представляется, что после углубленного изучения данного феномена и его достаточного статистического подтверждения этот диагностический тест станет краеугольным камнем в ранней диагностике БАС и позволит по-новому посмотреть на это заболевание, мониторировать возможность развития дегенерации в ЦНС на самых ранних этапах и остановить болезнь на ранних подступах. Очевидно, что установленные нами научные факты про-теомных нарушений в ГСК у пациентов с семейным БАС позволяют утверждать, что первичными являются геномно-протеомные изменения в ГСК, которые мы диагностируем у родственников больных БАС, не имеющих клинической манифестации, а только потом наступают нейродегенера-тивные изменения в мотонейронах. Геномно-протеомные нарушения ГСК так же первичны и при спорадическом БАС и возникают в результате воздействия этиологических факторов болезни на костный мозг пациента и ГСК, циркулирующие в периферической крови. Если принять нашу гипотезу, что БАС - это не болезнь моторного нейрона, а геномно-протеомная болезнь ГСК, то становятся понятными механизмы неэффективности терапии БАС стандартными способами, применяемыми для лечения аутоиммунных заболеваний. При большинстве аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз и рассеянный энцефаломиелит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит и т. д.) ГСК здорова, а аутоиммунная реактивность собственных лимфоцитов к ней-роспецифическим белкам нервной ткани формируется локально в периферических лимфоцитах. Следовательно, подавление их глюкокортикоидами и(или) иммуносупрессией, а также блокирование моноклональными антителами их секретомов в виде токсических цитокинов приводит к уменьшению их циркулирования в периферической крови и понижению уровня эксайтотоксичности, уменьшению аутореактивности и замещению их здоровыми потомками здоровой ГСК. Именно поэтому и работает аутогенная ТКМ и наступает полная длительная ремиссия болезни. В основе БАС и ряда похожих заболеваний лежит патологическая мутантная ГСК с измененным протеомом, которая постоянно производит аутореактивных к нервной ткани ИКК, потомков геномно-эпигеномно поврежденной ГСК. АутоТКМ в этих случаях не эффективна, как не эффективна иммуносупрессия иммунодепрессантами и глюкокортикоидными гормонами. Если принять, что БАС это генетически и эпигенетически наследственно детерминированное или приобретенное протеомное аутоиммунное заболевание ГСК, то этот научный факт объяснит неэффективность стандартной аутоиммунной терапии БАС и трансплантации собственных ГСК. заключение Новая методология ранней диагностики БАС позволяет структурировать инновационные подходы к геномным и постгеномным технологиям в диагностике и терапии БАС и определить молекулярно-биологические цели и мишени в лечении этих заболеваний. Наиболее вероятно, БАС может быть потенциально остановлен путем стандартной аллогенной гаплоидентичной (близкородственной) ТКМ. При терапии БАС аллоТКМ способна остановить прогрессирование смертельной болезни и предотвратить неизбежный летальный исход пациента, а последующее нейровосстановление поврежденных мотонейронов может быть проведено с применением всего арсенала биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), предназначенных для нейрорегенерации. Использовать аутогенные и аллогенные БМКП, содержащие ГСК, мезенхимальные стромальные СК и нейральные СК при БАС без остановки прогрессирования болезни малоэффективно и методологически ошибочно. Будущее терапии БАС мы видим в редактировании генома аутогенной ГСК и ее последующей трансплантации по протоколам ТКМ, а также в создании аутогенных генетически однородных клеточно-инженерных ГСК с гомотопной субституцией (равнозначной заменой) генома на геном здоровых соматических клеток и региональных СК негемопоэтического ряда. Возможно, что при БАС блокирование белков SOD-1 и FUS в аутоГСК позволит реализовать стратегию аутоТКМ с сайт-редактированными аутогенными ГСК. Эти биотехнологии в недалеком будущем при БАС могут стать биотехнологической платформой полного излечения от БАС и, возможно, еще целого класса инвалидизирующих ней-родегенеративных заболеваний человека. Однако дальнейшие исследования требуют значительно больших выборок пациентов и расширенной экспериментальной проверки установленных научных фактов. Важно отметить, что возможно и большинство других нейродегене-ративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, системные корковые атрофии и т. д.) имеют аналогичный аутоиммунный этиопатогенез, основанный на геномно-протемных изменениях в ГСК этих больных.

About the authors

A. S Bryukhovetskiy

Central Clinical Hospital of the RAS; CJSC “NeuroVita" Clinic

Email: neurovita-as@mail.ru

L. Y Grivtsova

A.F. Tsyb Medical Radiological Research Center, the branch of NMRRC

References

Supplementary files