Generation and characterization of human emryonic stem cells with increased expression of HIF-2a

Full Text

В организме человека большинство клеток и тканей в норме функционируют при концентрации кислорода менее 10%, и для регуляции гомеостатического баланса кислорода в процессе эволюции сформировались специальные механизмы. Ключевыми регуляторами клеточного ответа на понижение физиологического содержания кислорода (гипоксию) являются транскрипционные факторы HIFs, индуцируемые гипоксией [1, 2]. HIFs регулируют адаптивный ответ на недостаток кислорода путем активации ряда генов-мишеней [3-5]. На сегодняшний день установлено, что HIF играет важную роль в таких процессах, как обмен веществ, регулирование рН, доставка кислорода, метаболизм глюкозы, функционирование митохондрий, пролиферация клеток, синтез внеклеточного матрикса, мобилизация клеток при воспалении [1, 6, 7], а также в поддержании плюрипо-тентности, самообновлении эмбриональных стволовых клеток, васкуло- и ангиогенезе. Известно, что в области ишемических поражений в условиях недостатка кислорода, т. е. патологической гипоксии, повышается уровень белка HIF, который, будучи транскрипционным фактором, связывается с регуляторными областями генов-мишеней и повышает их транскрипцию, что приводит к усилению продукции ангиогенных цитокинов и, как следствие, усилению ангиогенеза [8-12]. Результаты исследований клеточного ответа на гипоксию имеют важное биомедицинское значение: в 2019 г. Уильяму Кэлину, Питеру Рэтклиффу и Греггу Семензе была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине «за открытие механизмов, посредством которых клетки воспринимают доступность кислорода и адаптируются к ней», в частности, за открытие и изучение транскрипционного фактора HIF [13]. развитие онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний часто протекает в условиях гипоксии [3, 14], поэтому изучение структуры и механизмов сигнального пути HIF имеет важное клиническое значение [15]. Было показано, что рост большинства типов опухолей сопровождается рядом процессов, таких как инвазия, метастазирование, ангиогенез, которые в основном регулируются генами-мишенями HIFs [15]. С другой стороны, на модели ишемии задних конечностей у мышей было обнаружено, что индукция ангиогенеза за счет активации HIFs является одной из возможных стратегий лечения ишемических заболеваний [6]. HIF представляет собой гетеродимер, в состав которого входит одна из изоформ кислород-регулируемой субъединицы HIF-a (HIF-1a, HIF-2a или HIF-3a) и конститутивно экспрессирующаяся субъединица HIF-1 р [6]. При нормальной концентрации кислорода происходит гидроксилирование аминокислотных остатков пролина HIF-a в результате активности фермента пролилги-дроксилазы. Для работы этих ферментов необходимы кислород, ионы двухвалентного железа и 2-оксоглутарат в качестве кофактора процесса гидроксилирования [16]. Модифицированная субъединица HIF-a, взаимодействуя c белком Гиппеля-Линдау, подвергается убиквитинирова-нию и деградирует в протеасомах. В условиях гипоксии не происходит гидроксилирования и протеасомной деградации белка HIF-a, он перемещается в ядро, образует димер с субъединицей HIF-1 р, и этот комплекс взаимодействует со специфическими последовательностями ДНК, активируя транскрипцию определенных генов. Для HIF-2a субъединицы известна кислород-неза-висимая регуляция с помощью белка Int6/eIF3e [17]. Взаимодействие Int6/eIF3e и HIF-2a приводит к деградации HIF-2a, в то время как нарушение взаимодействия с Int6/eIF3e - к стабилизации белка HIF-2a и усилению экспрессии мрНК гена HIF-2a. было доказано, что сайлен-синг Int6/eIF3e замедляет деградацию HIF-2a и стабилизированный белок HIF-2a связывается с участком последовательности ДНК в промоторном регионе гена HIF-2a, повышая уровень собственной экспрессии по принцину положительной обратной связи [18]. В ряде работ нокаут Int6/eIF3e рассматривают в качестве перспективного способа терапевтического ангиогенеза [19]. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека с повышенной экспрессией HIF-2a в условиях атмосферного содержания кислорода (около 21%) могут стать удобной моделью для изучения сигнального пути HIF, а их эндотелиальные производные с предполагаемым повышенным ангиогенным потенциалом - основой для разработки перспективных подходов к реваскуляриза-ции ишемических поражений. Целью данного исследования является получение эмбриональных стволовых клеток человека с повышенной экспрессией HIF-2a при нормальной концентрации кислорода за счет сайленсинга INT6, регулятора HIF-2a. Материал и методы Дизайн эксперимента Модуляцию экспрессии HIF-2a в линиях ЭСК человека HuES9 [20] и ESM04 [21, 22] проводили методом CRISPR/Cas9 для целевого выключения гена INT6, белковый продукт которого является ингибитором HIF-2a, что позволяет стабилизировать HIF-2a в условиях нормальной концентрации кислорода (21% O2). Эффект сайленсинга INT6 сравнивали с эффектом активации HIFs в условиях псевдогипоксии (обработка клеток известными веществами-миметиками гипоксии: хлоридом кобальта (CoCl2) и диметилоксалилглицином (DMOG), а также в условиях реальной гипоксии при культивировании в инкубаторе с пониженным содержанием кислорода (5%). Экспрессию генов INT6, HIF-2a и HIF-1a оценивали с помощью цифровой ПЦр в каплях. Культивирование ЭСК человека Клеточные линии ЭСК культивировали на подложке митотически инактивированных эмбриональных фибро-бластов мыши в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% СО2 атмосферной концентрации О2(около 21%) в среде Knockout DMEM (Thermo Fisher Scientific, США), содержащей 15% эмбриональной сыворотки телят (FBS, Thermo Fisher Scientific, США), 10 нг/мл pFGF (Peprotech, США), 1 х раствор Glutamax (Thermo Fisher Scientific, США), 1 х раствор заменимых аминокислот (Lonza, Швеция), 0,1 мМ 2-мер-каптоэтанола (Merck, Германия) и 1 х раствор антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Lonza, Швеция). При достижении субконфлюэнтного монослоя (плотность монослоя 80-95%) клетки пассировали с использованием TrypLE™ Express (Thermo Fisher Scientific, США) и 10 мкМ Rock-ингибитора Y-2 7632 (StemRD, США). Эксперименты по культивированию ЭСК в условиях пониженного содержания кислорода (5% О2) проводили в мультигазовом инкубаторе BINDER CB150 (BINDER, Германия) при 37°С, 5% СО2. Культивирование ЭСК человека в условиях псевдогипоксии (с использованием веществ-миметиков гипоксии) По литературным данным известно, что применение CoCl2 и DMOG способствует повышению экспрессии и стабилизации HIFs, имитируя гипоксическое состояние в клетке. CoCl2 хелатирует ионы Fe2+, которые являются кофактором, необходимым для работы пролил-гидроксилаз [23-27]. Нарушение гидроксилирования пролиновых остатков белка HIF-1a препятствует его деградации и приводит к стабилизации белка HIF-1a, как при гипоксии. Помимо стабилизации белка HIF-1a при обработке клеток CoCl2 достоверно повышается уровень экспрессии мРНК гена HIF-1a [25]. DMOG, действие которого направлено на ингибирование пролилгидроксилаз, стабилизацирует HIF-1a и HIF-2a [28, 29]. Таким образом, с помощью веществ-миме-тиков гипоксии можно смоделировать гипоксию при культивировании в условиях нормального содержания кислорода (около 21%). Клеточные линии ЭСК обрабатывали веществами-миметиками гипоксии CoCl2 и DMOG в концентрациях 50 мкМ и 250 мкМ соответственно в течение трех последовательных пассажей. Конструирование векторов и их доставка Для экспрессии Cas9 и направляющих рНК использовали вектор pSpCas9(BB)-2A-GFP(pX458) (https:// www.addgene.org/48138/) по ранее описанному протоколу [30]. Выбор последовательностей направляющих рНК и оценку нецелевых (off-target) взаимодействий Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов, необходимые для синтеза направляющих РНК системы CRISPR/Cas9 Направляющая РНК Последовательность (5’-3’) INT6 sgRNA № 1 5'-TCACTCGCGCCCTAACGCAA-3' 5'-TTGCGTTAGGGCGCGAGTGA-3' INT6 sgRNA № 2 5'-GCATCGCGCACTTTTTGGAT-3' 5'-ATCCAAAAAGTGCGCGATGC-3' Таблица 2. Последовательности праймеров и зондов для проведения цифровой ПЦр в каплях Праймеры Последовательность (5’-3’) TFRC F 5'-GTCGCTGGTCAGTTCGTGATT-3' TFRC_R 5'-AGCAGTTGGCTGTTGTACCTCTC-3' TFRC_Probe HEX-CCCATGATGTTGAATTGAACCTGG-BHQ1 HIF-2a_F 5'-TCATGCGACTGGCAATCAGC-3' HIF-2a_R 5'-GTCACCACGGCAATGAAACC-3' HIF-2a_Probe Probe: FAM-CTCTCCTCAGTTTGCTCTGAAA-BHQ1 HIF-1a F 5'-CCACAGGACAGTACAGGATG-3' HIF-1 a_R 5'-TCAAGTCGTGCTGAATAATACC-3' HIF-1a_Probe FAM-TGAGTTTCAACCCAGACATATCC-BH Q1 INT6_F 5'-GACACATTGTCTGAATTGCATTAAGAT-3' INT6_R 5'-CACTTCAGTCTCTTCAGCAGAGAAC-3' INT6_Probe FAM-TGATTGAAGAAAACAAACAGAGACCAGTGAATGA-BH Q1 проводили при помощи MIT CRISPR Design Tool (http:// crispr.mit.edu). Последовательности олигонуклеотидов указаны в табл. 1. Синтезированные олигонуклеотиды клонировали в вектор по сайтам рестрикции BbsI. Последовательность направляющих рНК в составе векторных конструкций верифицировали реакцией секвенирования плазмидной ДНК в ЦКП «Геномика» СО рАН. Генетические конструкции доставляли в клетки методом нуклеофекции на приборе Neon® Transfection System (Invitrogen Life Technologies, США). Отбор GFP-позитивных клеток выполняли через 48 ч. после нукле-офекции на проточном цитофлуориметре S3 (Bio-Rad, США) согласно рекомендациям производителя. Оценка пролиферации клеток с помощью XTT-анализа Клетки предварительно культивировали в 96-луноч-ном планшете в течение 24 ч. Пролиферацию ЭСК оценивали с использованием XTT-теста по протоколу фирмы-производителя (Roche, США) через 4 ч. после добавления реагентов на сканирующем спектрофотометре Perkin Elmer (2030 Multilabel Reader Victor X3, Финляндия) при длине волны 490 нм. Полученные значения коэффициента поглощения отражали количество жизнеспособных клеток в каждой лунке. Эксперимент проводили в двух технических и трех биологических повторностях. Выделение РНК и ДНК из клеток, синтез кДНК рНК и ДНК из клеток выделяли с помощью лизи-рующего реагента TRIzol Reagent® (Thermo Fisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали Random Hexamer Primer (500 мкг/мл, Promega, США) и M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen, США). Оценка экспрессии генов HIF-1a, HIF-2a, INT6 с помощью цифровой ПЦР в каплях Цифровую ПЦр в каплях проводили на базе ЦКП клеточных технологий ФИЦ ИЦиГ СО рАН с применением стандартного протокола фирмы-производителя ddPCR™ Total Guide bulletin 6407, набора ddPCR™ Supermix for Probes (10026235) и оборудования: ddPCR™ Foil Heat Seal, DG8™ Cartridges for QX100™/QX200™ Droplet Generator (1 86-4008), Droplet Generator DG8™ Gasket (186-3009), ddPCR™ Plate Kit (10023379), QX100™ Droplet Generator, QX100™ Droplet Reader, PX1™ PCR Plate Sealer, амплификатора Т100™ Thermal Cycler (все материалы, реактивы и оборудование фирмы BIORAD, США). Последовательности праймеров и зондов указаны в табл. 2. зонды подбирали с помощью онлайн программы PrimerQuest tool (eu.idtdna.com). Для нормирования использовали TFRC в качестве референсного гена, экспрессия которого стабильна в гипоксических и нормоксическихусловиях. Иммунофлуоресцентый анализ Плюрипотентность ЭСК оценивали с помощью имму-нофлуоресцентного окрашивания антителами на маркеры TRA1 -60, OCT 4, и SOX2 по ранее описанному протоколу [31]. Образцы анализировали на инвертированном флуоресцентном микроскопе Nikon Ti-E в программе NIS-AR (Nikon, Япония). Электрофорез в полиакриламидном геле и Вестерн блот-гибридизация Для электрофореза в полиакриамидном геле использовали метод Лэммли с модификациями. После электрофореза белки переносили на мембрану и детектировали при помощи первичных антиген-специфичных (HIF-2A: ab199, Abcam; HIF-1A: 458400, Life Technologies; INT6: 36766, Abcam) и вторичных антител (132222, Jackson ImmunoResearch Laboratories, IN C, 132960 Jackson ImmunoResearc Laboratori, INC), конъюгированных с пероксидазой. Количественный анализ данных Ве стерн-блота проводили в программе ImageJ. Статистический анализ Для обработки результатов qRT-PCR использовали 2-AACT метод [32], для статистической оценки достоверности различий - однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), а также критерий Пирсона в программе Microsoft Excel 14.0.6023.1000. Обработку и анализ результатов цифровой ПЦр в каплях проводили в программе Quanta Soft™ Software Version 1.7.4.0917. Результаты Получение эмбриональных стволовых клеток человека с делецией участка INT6 c помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 Для нокаута гена INT6 применили систему редактирования генома CRISPR/Cas9 с целью формирования делеции размером 220 п. н., включающей промоторную область и участок первого экзона с захватом точки начала транскрипции. Данный метод позволяет эффективно остановить транскрипцию гена. В результате сортинга GFP-позитивных клеток и последующего механического субклонирования было получено 43 субклона ЭСК линий HuES9 и ESM04. После первичного скрининга субклонов было выявлено 2 субклона H8 и Н9 линии HuES9 и 1 субклон Е12 линии ESM04 с делецией участка одного аллеля INT6 размером 218, 219 и 226 п. н. соответственно (рис. 1А, Б). По результатам секвенирования было обнаружено, что субклоны являются гетерозиготными по целевой делеции. Во втором аллеле гена IN T6 в субклонах также детектировали участки с делецией размером 7 п. н. (H9), 2 п. н. (Е12) и 8 п. н. (Н8) в промоторной обасти (рис. 1В). Характеристика полученных линий эмбриональных стволовых клеток человека с делецией участка гена INT6 Полученные генетически модифицированные субклоны демонстрировали наличие характерных маркеров плюрипотентности (рис. 1Г), а также нормальный пролиферативный потенциал, достоверно не отличающийся от пролиферативного потенциала контрольных клеточных линий без делеции и клеточных линий, культивируемых в условиях гипоксии и в присутствии веществ-миметиков гипоксии (рис. 2А, табл. 3). Оценка уровня экспрессии и количества белкового продукта гена INT6 Для оценки функциональной эффективности делеции гена INT6 на модуляцию экспрессии HIF-2a в полученных субклонах ЭСК и эффекта воздействия гипоксических и псевдогипоксических условий на экспрессию HIF-1a и HIF-2a использовали цифровую ПЦр в каплях. Было показано, что уровень экспрессии INT6 достоверно снижен в полученных субклонах с делецией данного гена по сравнению с контрольными образцами исходных линий (рис. 2Б). При оценке содержания белкового продукта INT6 в исследуемых клеточных линиях с помощью Вестерн-блот анализа (рис. 2В) было обнаружено снижение количества белкового продукта у субклонов Н9 и Е12 с делецией INT6. Кроме того, у субклона Е12 наблюдали появление дополнительного бэнда, что может свидетельствовать о протеасомной деградации данного белка [34]. Было выявлено увеличение количества белкового продукта INT6 в ЭСК, культивируемых в условиях гипоксии, для линии HuES9 и, напротив, снижение количества белка данного гена в клетках при обработке веществом-миметиком гипоксии DMOG. Для линии ESM04 было показано снижение количества белка INT6 в клетках, культивируемых в условиях гипоксии и в присутствии миметиков гипоксии (рис. 2В). результаты Вестерн-блот анализа согласуются с результатами, полученными с помощью цифровой ПЦР в каплях: делеция участка гена INT6 приводила к снижению количества белкового продукта данного гена в полученных субклонах. Оценка уровня экспрессии генов HIF-2a и HIF-1 a в полученных генетически модифицированных линиях ЭСК человека Оценка уровня экспрессии генов HIF-2a и HIF-1a методом цифровой ПЦР в каплях показала, что в генетически модифицированных субклонах H9 и E12 с делецией участка гена INT6 детектируется достоверно повышенный по сравнению с исходными линиями уровень экспрессии HIF-2a (рис. 2Г). При культивировании ЭСК в присутствии вещества-миметика гипоксии DMOG повышался уровень экспрессии как HIF-2a, так и HIF-1a; при культивирование в условиях гипоксического инкубатора с 5% кислорода, а также с добавлением вещества CoCl2 повышался уровень экспрессии HIF-1a (рис. 2Г). Таким образом, впервые было доказано, что делеция гена INT6 в субклонах ЭСК достоверно способствует повышению уровня экспрессии HIF-2a. Обсуждение Развитие эмбрионов млекопитающих происходит в условиях пониженного по сравнению с атмосферным содержания кислорода - 1 -5% [35]. Гипоксия играет существенную роль в поддержании плюрипотентности и самообновления ЭСК и индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток (ИПСК) человека [36, 37]. Культивирование плюрипотентных клеток при 5% O2 препятствует спонтанной дифференцировке, уменьшает частоту хромосомных аберраций, стабилизирует эпигенетическое состояние [38-41]. Гипоксия повышает эффективность направленной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в определенные типы клеток, позволяет поддерживать мультипотентность про-гениторных клеток [42-49], способствует репрограммированию соматических клеток к плюрипотентному состоянию [50]. Клетки, в которых активированы HIF-опосредованные сигнальные пути, помимо их способности поддержать плюрипотентность и эффективность дифференцировки, обладают повышенным регенеративным потенциалом, что очень важно для биомедицины, поэтому ведется разработка способов активировать HIF вне зависимости от процентного содержания кислорода в окружающей среде при культивировании. В нашей работе впервые были получены генетически модифицированные ЭСК человека с повышенной экспрессией HIF-2a в условиях культивирования при нормальном содержании кислорода (около 21%) в результате делеции участка промотора и первого экзона одного аллеля гена INT6, белковый продукт которого является рис. 1. Получение ЭСК человека, нокаутных по гену INT6: А - первичный скрининг полученных генетически модифицированных ЭСК человека, рамкой выделены продукты аллеля с делецией INT6 в субклонах Н8, Н9, Е12, В2 (контрольный субклон ИПСК с делецией INT6, ранее полученный в лаборатории [33]), контроль - HuES9 без делеции; Б - секвенограмма участка с целевой делецией (А, п. н.) одного из аллелей INT6 в субклонах H9, Е12, Н8; В - секвенограмма участка c делецией (А, п. н.) второго аллеля INT6 в субклонах H9, Е12, Н8; Г - субклоны Н9 и Е12 генетически модифицированных ЭСК человека линий HuES9 и ESM04: иммуноцитохимическая реакция с антителами к маркерам плюрипотентности - TRA1-60 (зеленый), OC T 4, SOX2 (красный). Ядра клеток докрашены DAPI (синий сигнал). Масштабный отрезок - 100 мкм таблица 3. Достоверность различий пролиферативного потенциала в исследуемых линиях ЭСК человека Линии ЭСК человека Р Линии ЭСК человека Р HuES9 и HuES9 DMOG 0,729 ESM04 и ESM04 DMOG 0,979 HuES9 и HuES9 LOW O2 0,790 ESM04 и ESM04 LOWO2 0,978 HuES9 и HuES9 CoCl2 0,797 ESM04 и ESM04 CoCl2 0,912 HuES9 и H9 0,704 ESM04 и E12 0,322 А £ * I 8 4 а -& § § 0 И X Р HuES9 HuES9 HuES9 HuES9 H9 LOW O2 DMOG CoCl2 I 8 4 а -& § m т § 0 ^ I X £ ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12 LOW O2 DMOG CoCL £0 Б 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О Т cj cj 0 cj cj (Г I* ii > i > > HuES9 HuES9 HuES9 HuES9 H9 ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12 LOW O2 DMOG CoCL LOW O2 DMOG CoCL В 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 о CD О CD ^ CO S £ p £ ° £3 £ a. s c о co S Ё P £ cj g ¥ a. S c О HuES9 HuES9 HuES9 HuES9 H9 ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12 LOW O2 DMOG CoCl2 LOW O2 DMOG CoCl2 48 кДА 42 кДА INT6 p-ACTIN ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12 HuES9 HuES9 HuES9 HuES9 H9 LOW O2 DMOG CoCl2 LOW O2 DMOG CoCl2 Г 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 cj cj 0 c" S $ rn ll £ 2 cj cj 0 c" s rn ll 4Э 2 . i I i ■ > > HuES9 LOW On HuES9 DMOG HuES9 CoCL HuES9 H9 cj cj 0 c" S rn ll £ 1 0 CQ О > HuES9 HuES9 HuES9 HuES9 H9 LOW O2 DMOG CoCl2 ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12 LOW O2 DMOG CoCl2 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0,5 0 О О (Г с" s rn ll £ 1 0 CQ О > I I ESM04 ESM04 ESM04 ESM04 E12 LOW O2 DMOG CoCL Рис. 2. Характеристика полученных генетически модифицированных ЭСК человека: А - оценка пролиферации линий ЭСК человека методом XTT-анализа: HuES9, ESM04 - исходные линии ЭСК; Н9 и Е12 - субклоны с делецией INT6: HuES9 DMOG, HuES9 CoCl2, ESM04 DMOG, ESM04 CoCl2-линии ЭСК, культивируемые в условиях псевдогипоксии; ESM04 Low O2, HuES9 Low O2 - линии ЭСК, культивируемые в условиях реальной гипоксии [5% O2]; Б - анализ экспрессии гена INT6 c помощью цифровой ПЦР в каплях; В - уровень белкового продукта INT6 в исследуемых линиях ЭСК человека, р<0,05 (n=2, значения для независимых биологических повторов - среднее ± стандартное отклонение среднего], белки детектировали с помощью антител к INT6 и р-актину; Г - экспрессия генов HIF-2a, HIF-1a, цифровая ПЦР в каплях, *р<0,05 по сравнению с исходными линиями ЭСК (n=3, значения для независимых биологических повторов, M±s) ингибитором HIF-2a. Известно, что INT6 - это ключевой компонент фактора инициации трансляции эукариот 3 (EIF3e), который играет важную роль во многих клеточных процессах, включая формирование рибосомального комплекса, протеасомную деградацию белков и пролиферацию. Таким образом, биаллельное нарушение экспрессии данного гена может быть потенциальным препятствием для реализации этого подхода, направленного на повышение активности HIF-2a, в качестве терапевтического метода лечения ишемических заболеваний [51]. Отсутствие протяженной делеции во втором аллеле приводит к неполному нокауту мРНК и белка INT6, благодаря чему, возможно, полученные гетерозиготные клоны ЭСК демонстрируют нормальную жизнеспособность, про-лиферативную активность и сохраняют маркеры плюри-потентности. Тем не менее, разработка терапевтически применимых способов усиления ангиогенеза на основе данного подхода требует дополнительных исследований. Нами был проведен сравнительный анализ эффекта действия делеции участка гена INT6 на HIF-2a с действием миметиков гипоксии CoCl2 и DMOG, а также с эффектом культивирования исходных ЭСК в условиях СО2-инкубатора при 5% кислорода. Уровень экспрессии HIF-2a в генетически модифицированных субклонах ЭСК H9 и E12 линий HuES9 и ESM04 соответственно с делецией участка INT6 был повышен, так же как при длительном культивировании ЭСК в условиях гипоксии [40, 52, 53]. При культивировании контрольных линий ЭСК (HuES9 и ESM04) в условиях гипоксического инкубатора при 5% О2, а также в случае обработки хлоридом кобальта был обнаружен эффект, характерный для стадии адаптации к гипоксии - достоверное повышение экспрессии HIF-1 a, а не HIF-2a. Несмотря на то, что культивирование в экспериментальных условиях инкубатора с 5% О2 проводили на протяжении трех пассажей, по-видимому, этого было недостаточно для начала экспрессии HIF-2a. Действие CoCl2 направлено именно на HIF-1a, тогда как обработка веществом-миметиком гипоксии DMOG не только повышает экспрессию HIF-1a в обеих линиях ЭСК, но и приводит к повышению экспрессии HIF-2a. Это согласуется с данными о том, что DMOG одновременно стабилизирует в клетках HIF-1a и HIF-2a [54]. Полученные нами генетически модифицированные ЭСК человека с повышенной экспрессией HIF-2a, с одной стороны, могут стать объектами для изучения механизмов связи гипоксии и плюрипотентности, с другой стороны, благодаря способности дифференцироваться в эндотелиальные производные с повышенным ангиогенным потенциалом, могут стать основой для разработки нового способа реваскуляризации при ишемических поражениях.

About the authors

M. K Zhiven

Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center

Email: zhiven92@mail.ru

I. S Zakharova

Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center

A. I Shevchenko

Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center

E. A Elisaphenko

Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center

K. E Orishchenko

Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the RAS

S. M Zakian

Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center

References

Supplementary files