Clinical Evaluation of the efficiency of allogeneic cord blood transfusion in patients with autism

Full Text

Введение Расстройство аутистического спектра (РАС) - это нарушение психического развития с клинической манифестацией в младенчестве или детстве, характеризующееся стойким дефицитом способности начинать и поддерживать социальное взаимодействие и общественные связи, а также ограниченными интересами и часто повторяющимися поведенческими действиями. По данным ВОЗ на 2019 г. 1 ребенок из 160 страдает РАС [1]. Точная этиология аутизма остается неясной. Предполагают несколько механизмов возникновения заболевания, один из которых может включать иммунную дисрегуляцию. Некоторые данные указывают на аномалии в иммунной системе, включая активное нейровоспаление в головном мозге, повышенный уровень провоспалительных цитокинов, дисфункцию иммунных клеток и наличие аутоиммунитета [2]. Дополнительные исследования показали количественные изменения в субпопуляциях иммунных клеток [3, 4] что приводит к неадекватному иммунному ответу при аутизме. Существующие в настоящее время терапевтические подходы к лечению аутизма можно классифицировать как поведенческие, образовательные, медицинские, смежные медико-санитарные и альтернативные методы [5]. Однако для детей с аутизмом нет определенного стандартного лечения. Терапия стволовыми клетками показала хорошие перспективы в современном лечении и реабилитации пациентов с аутизмом [6]. В доклинических испытаниях было доказано, что трансплантация мононуклеаров пуповинной крови человека животным с моделью ишемии головного мозга способствует уменьшению зоны ишемического поражения через антиапоптотический, иммуномодулирующий механизм и неоваскулоге-нез. [7]. Некоторые исследования подтвердили, что церебральная гипоперфузия связана со многими Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 75 основными симптомами аутизма [8]. Гипоперфузия головного мозга, выявленная в лобной и префронталь-ной областях, наблюдалась у детей с аутизмом и была связана с когнитивными и нейропсихологическими дефектами. Кроме того, снижение церебральной перфузии, особенно в височно-париетальных областях, коррелировало с когнитивными нарушениями, такими как дефицит речи, ухудшение когнитивного развития, распознавание визуальных объектов, а также аномальное восприятие и ответы на сенсорные стимулы. Неадекватная перфузия, приводящая к гипоксии тканей головного мозга, не только вызывает апоптоз и некроз нейронов, но также приводит к аномальному метаболизму в нейронах и патологическому накоплению нейротрансмиттеров [8]. терапевтический ангиогенез был продемонстрирован при системной трансфузии CD34+-клеток пуповинной крови на экспериментальных животных [7]. Было доказано, что клетки-предшественницы эндотелиоцитов, содержащиеся в популяции CD34+-клеток, обладают способностью инициировать ангиогенез в ишемических тканях. Циркулирующие CD34+-клетки-предшественницы пуповинной крови с потенциалом трансформации в эндотелиоциты принимают участие в восстановлении поврежденного эндотелия и образовании новых кровеносных сосудов. Более того, CD34+-клетки человека и гемопоэтические клетки-предшественницы могут синтезировать многочисленные ангиогенные факторы, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), HGF и инсулиноподобный фактор роста 1 [7]. Единичные публикации о результатах ограниченных клинических исследований по трансфузии мононукле-арных клеток пуповинной крови детям с рас показали, что данный метод является безопасным для детей [9]. однократная трансфузия клеток пуповинной крови приводила к снижению тяжести симптомов аутизма и повышению уровня социализации детей [10, 11]. таким образом, продолжение исследования безопасности и эффективности трансфузии гемопоэтических клеток пуповинной крови у детей с рас актуально. Цель исследования: провести оценку безопасности и эффективности трансфузии аллогенных гемопоэтиче-ских клеток пуповинной крови у пациентов с РАС. Материал и методы Исследование по оценке безопасности и эффективности трансфузии аллогенных гемопоэтических клеток пуповинной крови у пациентов с РАС было выполнено методом выборочного статистического наблюдения на базе ГБУЗ «Самарский областной медицинский центр Династия» и ГБУЗ «Самарская областная детская клиническая больница № 1 им. Н.Н. Ивановой» и одобрено на совместном заседании этических комитетов этих учреждений (протокол № 25 от 15.11.2018). тип исследования: ограниченное нерандомизированное проспективное клиническое исследование с контрольной группой, исследование I фазы. В основную группу были включены 10 детей: 8 мальчиков и 2 девочки в возрасте от 4 до 1 4 лет (средний возраст-7,01+2,02 лет), которые постоянно проживают в Самарской области и наблюдаются в психоневрологическом диспансере с диагнозом РАС. В группу контроля вошли 10 детей: 8 мальчиков и 2 девочки в возрасте от 4 до14 лет (средний возраст - 7,04+2,09 лет), которые были максимально идентичны пациентам из основной группы, подобраны по методу «пара копий» по таким признакам, как место жительства (проживание в Самарской области не менее 10 лет), пол, возраст, наблюдение в психоневрологическом диспансере с диагнозом РАС. Главным отличительным признаком группы контроля было отсутствие интервенционного воздействия в виде трансфузии аллогенных гемопоэтических клеток пуповинной крови. Критерии включения в исследование: подтверждённый врачом-психиатром диагноз аутизм, системное отставание в развитии речи, наличие синдрома дефицита внимания и гиперактивности, как сопутствующего состояния, когнитивные нарушения, возраст от 3 до 15 лет, подписанное информированное согласие законными представителями ребёнка. Критерии невключения: органическая патология мозга по данным компьютерной томографии, МРт; наличие в анамнезе следующих заболеваний: сердечная недостаточность в стадии декомпенсации; заболевания крови; декомпенсация хронических и эндокринологических заболеваний; ВИЧ-инфекция, гепатиты В и С; острые респираторные вирусные и бактериальные инфекции, период менее 1 месяца после острой фазы; онкологические заболевания, химиотерапия в анамнезе; туберкулез; тяжелая форма умственной отсталости; церебральный паралич; эпилепсия. Аллогенная пуповинная кровь была подобрана для реципиентов (основная группа) из публичного банка пуповинной крови ГБУЗ МЦ Династия (Самара, Россия) по критериям совместимости по группе крови и Rh-фактору. Клетки пуповинной крови отмывали от криопротектора и ресуспендировали в физиологическом растворе 0,9% хлорида натрия (Синтез, Россия). трансфузию (внутривенное введение) клеток пуповинной крови осуществляли в концентрации не менее 8-10х107 кл/кг веса пациента с использованием шприцевого дозатора (Браун, США) со скоростью 1,0-1,5 мл/мин. В начале трансфузии проводили биологическую пробу на совместимость в присутствии врача-трансфузиолога и врача-реаниматолога. После трансфузии врач-трансфузиолог наблюдал пациента не менее 60 мин. Было выполнено 3 трансфузии с интервалом в 1 мес. Методы оценки безопасности и эффективности трансфузии клеток пуповинной крови включали непосредственное наблюдение, а также социологический (шкала АтЕС) и аналитический методы. Критерии оценки безопасности: мониторинг нежелательных реакций, плановые осмотры врачей (невролог, педиатр, психиатр по месту диспансерного наблюдения), проведение лабораторных исследований в течение 12 мес. (до начала лечения и через 1, 2, 6, 12 мес. после лечения). Возможные ожидаемые нежелательные реакции: высыпания на коже и слизистых оболочках, гипертермия, озноб, слабость, сонливость, гиперактивность, нарушение сна, изменение аппетита, явления диспепсии. Критерии оценки эффективности: Достоверные изменения при сравнении с группой контроля по четырем разделам оценочной шкалы АтЕС (Autism Treatment Evaluation Checklist): I раздел - речь, язык, коммуникативные навыки (14 позиций); II раздел - социализация (20 позиций); III раздел - сенсорные навыки и познавательные способности (18 позиций); IV раздел - здоровье, физическое развитие, поведение (25 позиций). Оценку по шкале ATEC проводили до начала лечения и через 1, 2, 6, 12 мес. после лечения. Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 76 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2. Значимые изменения лабораторных показателей содержания цитокинов: IL1b, IL6, TNF-alpha, IL8, y-IFN в периферической крови пациента до начала лечения и через 6 мес. после лечения. 3. Значимые изменения лабораторных показателей абсолютного и относительного содержания субпопуляций лимфоцитов (CD3+; CD3+CD8+; CD3+CD4+; CD1 6+CD56+ и CD19+) до начала лечения и через 6 мес. после лечения. Материалом для лабораторных исследований служили периферическая кровь и сыворотка крови. Определение субпопуляций лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии с использованием набора Multitest 6-color TBNK with BD Trucount tubes (Becton Dickinson, США), проточного цитофлюориметра BD FACS Canto (Becton Dickinson, США) и программного обеспечения BDFACS Canto Software (Becton Dickinson, США). Концентрацию цитокинов определяли количественным «сэндвич»-методом иммунофермент-ного анализа с применением наборов для определения концентрации цитокинов в сыворотке крови (Вектор-Бест, Россия) и микропланшетного ридера Mindray MR-96A (Mindray, Китай). Статистический анализ Статистическую обработку полученных результатов проводили методами параметрической и непараметрической статистики в программах STATA version 9.0, Statistica for Windows версии 6.0 и MS Office Excel 2007. Сравнение данных в основной группе в течение всего срока наблюдения осуществляли с помощью критерия Уилкоксона, сравнение данных между основной группой и группой контроля - непараметрическим методом с помощью U-критерия Манна-Уитни (данные представлены в формате Me - медиана с указанием 25% (q1) и 75% (q3) квартиля. Клиническое исследование зарегистрировано в международном регистре клинических исследований (gov ID: NCT03786744) Начало исследования: октябрь 12, 2018 г. Окончание исследования: декабрь 12, 2019 г. Результаты Безопасность трансфузии аллогенных гемопоэтических клеток пуповинной крови пациентам с РАС Ранних посттрансфузионных осложнений (первые сутки после инфузии), угрожающих жизни пациентов, не наблюдалось. Ранние нежелательные реакции были зафиксированы у 3 (30%) детей из 10: одного ребенка беспокоила боль в месте инъекции, у 2 детей было отмечено повышенное беспокойство в течение 2 ч. после трансфузии. В течение 12 мес. нежелательные реакции (явления) наблюдались у 6 пациентов (60%) основной группы: у одного пациента было диагностировано острое респираторное заболевание (ОРВИ), обострение хронического пиелонефрита, периодические головные боли; у второго пациента - ОРВИ, пищевая токсикоинфекция; у третьего пациента - ОРВИ, обострение хронического бронхита, сезонный аллергический ринит; у четвёртого пациента - ОРВИ, обострение хронического гастрита, периодические головные боли; у пятого пациента - ОРВИ, пищевая токсикоинфекция, периодические приступы агрессии, периодические головные боли; у шестого пациента - ОРВИ. В группе контроля в течение 12 мес. нежелательные реакции были зафиксированы у 7 пациентов (70%): у одного пациента было диагностировано ОРВИ, периодические головные боли; у второго пациента - ОРВИ, пищевая токсикоинфекция; периодические приступы агрессии; у третьего пациента - ОРВИ, сезонный аллергический ринит, периодические приступы агрессии; у четвёртого пациента - ОРВИ; обострение хронического бронхита, сезонный аллергический ринит; у пятого пациента - ОРВИ, обострение хронического гастрита, растяжение связок голеностопного сустава; у шестого пациента - ОРВИ, сезонный аллергический ринит, периодические приступы агрессии, обострение хронического гастрита; у седьмого пациента - ОРВИ, перелом луча в типичном месте (табл. 1 ). Значимых различий по нежелательным реакциям в течение 1 года между группами выявлено не было. В основной группе была обнаружена положительная динамика по следующим показателям: прекращение самопроизвольной дефекации у 3 пациентов; улучшение аппетита и расширение пищевого рациона у 2 пациентов; улучшение познавательной деятельности (концентрация внимания, выполнение инструкций к предложенным заданиям) в рамках специально организованных занятий (индивидуальных) - у пяти пациентов; увеличение объема самостоятельности и звукоподражательных высказываний с яркой интонацией к выполненному заданию (найти предмет по номинанту) - у четырёх пациентов. Эффективность трансфузии аллогенных гемопоэтических клеток пуповинной крови пациентам с РАС При определении эффективности трансфузии по 4 разделам шкалы АтЕС были получены следующие результаты, которые выражали в баллах: 1. по I разделу (речь, язык, коммуникативные навыки): в основной группе до трансфузии - 14 (10; 20) баллов, в группе контроля -14 (13; 21); через 12 мес. после трансфузии в основной группе -12 (6; 17) баллов, в группе контроля - 15 (10; 20) (p>0,05). Достоверные улучшения у пациентов в основной группе по отношению к контролю были зарегистрированы через 2 мес. (p=0,04), однако через 12 мес. показатели достоверно не различались (p>0,05). 2. по II разделу (социализация): в основной группе до трансфузии -11 (13; 21) баллов, в группе контроля - 11 (9; 15); через 12 мес. в основной группе - 12 (8; 14) баллов, в группе контроля - 14 (11; 14). Несмотря на то, что показатели социализации у пациентов в основной группе были лучше, чем в контрольной и в течение 1 2 мес. разрыв в показателях увеличивался, разница оставалась недостоверной (p>0,05). 3. по III разделу (сенсорные навыки, познавательные способности): в основной группе до трансфузии - 13 (9; 14) баллов, в группе контроля - 12 (10; 15), через 12 мес. в основной группе - 12 (7; 13) баллов, в группе контроля -13 (11; 17) (p>0,05); Показатели у пациентов основной группы на протяжении всего срока наблюдения были лучше, чем у пациентов в контрольной группе, однако статистически они были недостоверны (p>0,05). 4. по IV разделу (здоровье, общее поведение): в основной группе до трансфузии - 24 (19; 30) баллов, в группе контроля - 24 (19; 30); через 12 мес. в основной группе - 13 (10; 17) баллов, в группе контроля - 22 (19; 30) (p=0,01), наилучшие результаты были получены через 2 мес. (p=0,004) и 12 мес. (p=0,01) по сравнению с контрольной группой и оценкой до начала терапии (рис. 1). Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 ОРИГИНАЛьНыЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 77 Таблица 1. Оценка нежелательных реакций (явлений) за период наблюдения (1 год) Нежелательные реакции Основная группа, n=10 Контрольная группа, n=10 Инфекционной природы Заболевания органов дыхания и верхних дыхательных путей (в т. ч. ларингит, трахеит, ОРВИ) 6 7 Заболевания сердечно-сосудистой системы 0 0 Заболевания опорно-двигательного аппарата 0 0 Заболевания мочеполовой системы 0 0 Заболевания желудочно-кишечного тракта (пищевая токсикоинфекция) 2 1 Заболевания кожи и подкожно-жировой клетчатки 0 0 Заболевания нервной системы 0 0 Неинфекционной Заболевания органов дыхания и верхних дыхательных путей 1 1 природы Заболевания сердечно-сосудистой системы 0 0 Заболевания опорно-двигательного аппарата 0 2 Заболевания мочеполовой системы 1 0 Заболевания желудочно-кишечного тракта (гастрит) 1 2 Заболевания кожи и подкожно-жировой клетчатки 0 0 Заболевания нервной системы 0 0 Психиатрические расстройства (агрессия, возбудимость) 1 3 Неврологические расстройства (головная боль, головокружение) 3 1 Аллергические реакции (сезонные аллергические реакции) 1 3 Аутоиммунные заболевания 0 0 Рис. 1. Оценка эффективности трансфузии клеток пуповинной крови пациентам с РАС по IV разделу оценочной шкалы АТЕС - здоровье, общее поведение Рис. 2. Оценка эффективности трансфузии клеток пуповинной крови пациентам с РАС по V разделу оценочной шкалы АТЕС - общий итог При итоговой оценке эффективности по шкале АТЕС были получены следующие результаты: в основной группе до трансфузии - 63 (56; 66) баллов, в группе контроля - 62 (59; 73); через 12 мес. в основной группе - 55 (38; 61) баллов, в группе контроля - 71 (60; 81) (p<0,05); значимые улучшения показателей были выявлены через 2, 6 и 12 мес. (p<0,05) по сравнению с показателями контрольной группы и оценкой до начала терапии (рис. 2). Оценка показателей абсолютного и относительного содержания субпопуляций лимфоцитов в основной группе не выявила каких-либо статистически значимых отклонений от нормы, как до начала исследования, так и через 6 мес. после трансфузии клеток (табл. 2). При сравнении цитокинового профиля до трансфузии и через 2 и 6 мес. после трансфузии в основной группе не было обнаружено значимых различий (табл. 3). Обсуждение Настоящее исследование было проведено с целью оценки безопасности и эффективности трансфузии алло-генных гемопоэтических клеток пуповинной крови детям Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 78 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таблица 2. результат оценки показателей субпопуляций лимфоцитов периферической крови Показатели субпопуляций лимфоцитов периферической крови До лечения Через 6 мес. p CD3+ % 61,24 63,71 абс. значение, х106л 1450,355 1829,11 >0,05 CD3+CD8+ % 24,33 25,345 абс. значение, х106л 598,48 654,385 >0,05 CD3+CD4+ % 32,835 32,555 абс. значение, х106л 750,08 877,095 >0,05 CD16+CD56+ % 15,19 16,05 абс. значение, х106л 321,89 476,055 >0,05 CD19+ % 19,29 17,255 абс. значение, х106л 457,505 506,365 >0,05 CD3+CD4+/CD3+CD8+ % 0,215 0,31 абс. значение, х106л 5,555 8,565 >0,05 Таблица 3. Результат оценки показателей содержания цитокинов Цитокины до трансфузии 1 мес. 2 мес. 6 мес. p y-IFN pg/ml 0 0 0 0 >0,05 IL1b, pg/ml 1,23 1,28 1,97 2,794 >0,05 IL6, pg/ml 1,02 0,67 0,56 0,75 >0,05 IL8, pg/ml 3,9 2,8 2,75 4,80 >0,05 TNF-alpha, pg/ml 0 0 0 0 >0,05 с расстройством аутистического спектра. Полученные данные свидетельствуют, что трансфузия гемопоэтических клеток пуповинной крови, совместимых по группе крови и Rh-фактору, и концентрацией не менее 8-10х107кл/ кг веса пациента не приводит к трансфузионным осложнениям в краткосрочном и долгосрочном периодах. Из нежелательных реакций были зафиксированы психомоторное возбуждение, агрессивное поведение, респираторные инфекции, как в основной группе, так и в группе контроля, что соответствует данным других авторов [6, 9]. Позитивные изменения в поведении детей в основной группе наблюдались уже в первый месяц после трансфузии клеток по всем показателям шкалы ATEC. Наиболее значимые и достоверные различия между группами были выявлены в разделах IV (здоровье, общее поведение) через 1 мес. после второй трансфузии и через 12 мес. после первой трансфузии и V (общий итог) в течение всего срока наблюдения. результаты исследования показателей абсолютного и относительного содержания субпопуляций лимфоцитов не выявили каких-либо статистически значимых отклонений от нормы, как до начала исследования, так и после трансфузии клеток. Отличие полученных результатов от результатов других авторов возможно связано с небольшой выборкой [3]. Отсутствие значимых изменений цитокинового профиля у пациентов как до, так и после трансфузии клеток, противоречит данным других научных групп [2], что, с одной стороны, может быть связано с небольшой выборкой, а с другой - свидетельствовать об отсутствии у таких пациентов воспалительного компонента, сопровождающегося изменением концентрации провоспалительных цитокинов. Выводы 1. Метод трансфузии аллогенных гемопоэтических клеток пуповинной крови безопасен при лечении детей с аутизмом. 2. Оценка по шкале АТEС показала, что через 12 мес. после начала лечения значимо улучшились показатели уровня общего здоровья, физического развития и поведения у пациентов основной группы с 63 (56; 66) баллов (в группе контроля - 62 (59; 73), до 55 (38; 61) баллов (в группе контроля - 71 (60; 81) (p<0,05). 3. Значимых изменений цитокинового профиля и иммунного статуса у пациентов основной группы до трансфузии и через 6 мес. после выявлено не было. Таким образом, применение трансфузии аллогенных гемопоэтических клеток пуповинной крови является перспективным методом лечения детей с аутизмом, как дополнение к базовой терапии. Необходимо продолжение клинического исследования «безопасность и эффективность» с увеличением когорты пациентов.

About the authors

O. V Tyumina

Samara Regional Medical Center Dynasty; Samara Medical University

S. E Volchkov

Samara Regional Medical Center Dynasty

P. A Ovchinnikov

Samara Regional Medical Center Dynasty

L. M Trusova

Samara Regional Medical Center Dynasty

A. I Bugakov

Samara Regional Medical Center Dynasty

S. A Romanova

N.N. Ivanova Samara Regional Children's Clinical Hospital

L. V Bumagina

N.N. Ivanova Samara Regional Children's Clinical Hospital

O. O Galahova

N.N. Ivanova Samara Regional Children's Clinical Hospital

References

Supplementary files