Genetic diagnostics and treatment of young adult acute myelomonoblastic leukemia patient using double haploidentic bone marrow transplantation

Full Text

Введение Диагностика и лечение острых миелоидных лейкозов (ОМЛ), относящихся к группе неблагоприятного генетического прогноза, являются одной из актуальных задач современной онкогематологии. В качестве основной стратегии, направленной на улучшение общей вероятностной выживаемости таких пациентов, используется интенсивная химиотерапия с последующей аллогенной трансплантацией костного мозга в первой ремиссии. Применяют как аллогенные HLA-совместимые, так и гаплоидентичные трансплантации. Стратегии лечения больных ОМЛ, не достигших ремиссии, схожи, но эффективность их недостаточна и ограничена в основном продлением жизни на 12-18 мес., несмотря на применение инновационных технологий таргетной, иммунной и клеточной терапии [1-4]. Цель исследования - проанализировать случай диагностики и лечения острого миеломонобластного лейкоза с неблагоприятным генетическим прогнозом у больной молодого возраста с применением двойной гаплоидентичной трансплантации костного мозга. Материал и методы Исследовали пробы костного мозга и периферической крови больной К., 35 лет, получавшей программное химиотерапевтическое лечение, а впоследствии - двойную гаплоидентичную трансплантацию костного мозга и иммуносупрессивную терапию в Свердловском областном онкогематологическом центре. Общая продолжительность наблюдения больной составила 50 мес. Перед исследованием пациентка подписала информированное согласие. Диагностику ОМЛ осуществляли на основании клинической картины, цитологического анализа крови и костного мозга, цитохимического, иммунофеноти-пического [4, 5] и цитогенетического исследований (G-banding). Для выявления специфических хромосомных аномалии и детекции генных мутаций в кодирующих последовательностях экзонов 7-12 и 16-19 гена c-KIT, 18-26 гена DNMT3A, 9-12 гена NPM1, 1-4 гена NRAS и 4-11 гена ТР53 методом прямого автоматического секвенирования проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени. Методики, использовавшиеся для детекции мутаций, технологии выделения РНК и секвенирования кДнК, описаны нами ранее [2, 6-8]. Моделирование мутаций исследуемых белков выполняли с помощью распределенной сети предсказания структуры Protein Homology/AnalogY Recognition Engine версии 2,0 в режиме Intensive. В качестве референтных использовали полученные методом рентгеноструктурного анализа модели из Protein Data Bank: для белка Dnmt3A-Dmnt3L - модель 6F57 с разрешением 3,10А [9], для белка с-Kit - модель 1PKG с разрешением 2,90А [10]. Для визуализации и анализа применяли программное обеспечение PyMol версии 2,3.4. Результаты У пациентки К. заболевание манифестировало с появления субфебрилитета до 380С, артралгий, геморрагий на коже и слизистых, стоматита и десневых кровотечений. В клиническом анализе крови уровень гемоглобина равнялся 70 г/л, лейкоцитов - 29,2х103/мкл (бласте-мия - 29,0%), тромбоцитов - 47х103/мкл. В костном мозге при умеренной клеточности 17 000/мкл бласт-ные клетки составляли 28,4%, моноциты - 6,4%. Бласты в препаратах костного мозга располагались неравномерно, имели средние размеры, их ядро содержало 1 -2 нуклеолы, в цитоплазме были обнаружены азуро-фильная зернистость и палочки Ауэра. Мегакариоциты были единичными, отмечалось неравномерное созревание ядра и цитоплазмы нейтрофилов. Цитохимические реакции на липиды были положительны в 7,0% бластов, крупно- и мелкогранулярный гликоген был определен в цитоплазме 24,0% бластных клеток, диффузный - 22,0%. Иммунофенотип лейкозных клеток: 28,0% экспрессировали HLA-DR, CD13, CD33, CD34, CD38, CD117, MPO-cyt, 13,0% - CD33, CD11cyt, CD64, CD 14. На основании данных морфологического исследования у больной был диагностирован ОМЛ, вариант М4 по FAB-классификации. При дополнительном обследовании в биохимическом анализе крови был определен повышенный уровень ЛДГ (533 Е/л), по УЗИ органов брюшной полости - небольшая гепатоспленомегалия (печень 142x44 мм, селезенка 67 см2). При цитогенетическом исследовании был выявлен аберрантный кариотип лейкозных бластов с формированием анеуплоидных субклонов: 48, XX, +4, +21 [2]/47, ХХ, +4 [3]/46, ХХ [2]. Транскрипты химерных генов BCR-ABL, AML-ETO, AML-EVI1 и CBFB2-MYH11 методом ПЦР в режиме реального времени обнаружены не были. Методом прямого секвенирования были определены несинонимичные замены с. 2644 С>Т в гене DNMT3A и с. 2447 A>T в гене с-KIT (рис. 1), являющиеся, по данным литературы, значимыми в патогенезе ОМЛ [8, 11]. Кроме того, в экзоне 6 гена ТР53 был выявлен полиморфный аллельный вариант с.215 C>G, не имеющий клинического значения при ОМЛ [2]. Исследованные кодирующие последовательности остальных генов полностью соответствовали референтным, то есть «дикому» типу. Для персонификации прогноза было выполнено компьютерное моделирование выявленных мутаций с использованием распределенной сети предсказания структуры белка. Было обнаружено, что остаток аргинина в положении 882 белка Dnmt3a является одним из ключевых для осуществления метилирования ДНК по двум причинам. Во-первых, образуя водородную связь с фосфатной группой в положении N+3 относительно CpG-сайта, он участвует в каскаде комплементарных взаимодействий между ДНК и метилтрансферазой, включающем ковалентную связь с Cys710 каталитической петли, а также водородные, электростатические и Ван-дер-Ваальсовы связи с элементами TRD-петли. Гены & Клетки, том XV, № 4, 2020 72 КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ Рис. 1. Детекция мутаций в генах DNMT3A (А) и c-KIT (B) при ОМЛ М4 Рис. 2. Взаимодействия Arg882, TRD-петли и фосфатной группы ДНК в белке Dnmt3A «дикого» типа (А) и их нарушение при мутации R882C (Б) Во-вторых, за счет формирования водородной связи с остатком серина в положении 837, он обеспечивает оптимальную конформацию TRD-петли, необходимую для связывания с молекулой ДНК (рис. 2А). Выявленная мутация с. 2644 С>Т в метилтрансферазном домене приводила к замене Arg882 на цистеин (p. 882 R>C), который не обладал протяженной боковой цепью, а его единственная сульфгидрильная группа не способна к формированию устойчивых водородных связей с фосфатной группой и с Ser837 (рис. 2B). Данные изменения в структуре приводили к дестабилизации TRD-петли, нарушению формирования комплекса Dnmt3A-Dnmt3L-ДНК и, как следствие, снижению его каталитической активности на 40-80% [11, 12]. Компьютерное моделирование мутации с. 2447 А>Т в гене с-KIT, приводящей к аминокислотной замене p. 816 D>V в активационной петле, показало, что она также индуцировала значимые структурные нарушения. В первую очередь, изменялась структура активационной петли из-за нарушения формирования водородной связи между Asp816 и Asn819, обусловливающее, в свою очередь, развертывание 310-спирали и спонтанную активацию рецептора. Во-вторых, в результате дрейфа JM-региона за пределы каталитически активной области происходило высвобождение сайтов фосфорилирования и связывания с субстратом, что также способствовало переходу белка в активное состояние [13, 14]. Таким образом, онкогенность выявленных миссенс-мутаций в генах DNMT3A и с-KIT была подтверждена с помощью компьютерного моделирования структуры белка. Лечение больной проводили по протоколу ОМЛ 01,10 Российской исследовательской группы по изучению острых лейкозов. В фазе индукции ремиссии применялось два курса «7+3»: цитарабин 100 мг/ м2 с 1 по 7 сут., даунорубицин 60 мг/м2 с 1 по 3 сут. [4]. В постцитостатическом периоде была диагностирована фебрильная нейтропения, по поводу которой пациентка получала антибиотики широкого спектра действия и противогрибковые препараты. На +20 сут. после окончания первого курса индукции на фоне восстановления показателей периферической крови была диагностирована первая ремиссия. Содержание бластных клеток в аспирате костного мозга составило 1,8%. В связи с неблагоприятным прогнозом и поиском неродственного HLA-совместимого донора в международных регистрах, консолидацию осуществляли тремя курсами цитарабина в дозе 3000 мг/м2 2 раза в сут. в 1, 3 и 5 сут. После их завершения ремиссия сохранялась. Из-за отсутствия возможности инициации неродственного HLA-совместимого донора, было принято решение о проведении гаплоидентичной трансплантации от старшей дочери пациентки (возраст 15 лет). Для подготовки к трансплантации применяли режим кондиционирования со сниженной интенсивностью: бусульфан 4 мг/кг на -4 и -3 сут. в сочетании с флюдара-бином 50 мг/м2 внутрь с -7 по -2 сут. Для профилактики острой реакции трансплантат против хозяина использовали циклофосфамид внутривенно на +3 и +4 сут., в последующем - микофенолат мофетил и такролимус. На +51 сут. в связи с персистирующей панцитопенией была осуществлена трансфузия донорских лейкоцитов старшей дочери с коррекцией схемы иммуносупрессии. На +71 сут. от первой трансплантации, учитывая длительную персистенцию панцитопении, была выполнена вторая гаплоидентичная трансплантация костного мозга от младшей дочери пациентки (возраст 8 лет) и повторная коррекция иммуносупрессивной терапии. В результате, на +28 сут. после второй трансплантации в клиническом анализе крови было достигнуто Гены & Клетки, том XV, № 4, 2020 КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ 73 восстановление показателей до субнормального уровня. При исследовании аспирата костного мозга на +34 сут. была подтверждена ремиссия ОМЛ и 100% донорский химеризм. В виду отсутствия признаков острой реакции трансплантат против хозяина иммуносупрессия была завершена на +6 мес. после второй трансплантации. На втором году после трансплантации у пациентки развилась хроническая болезнь трансплантат против хозяина с поражением кожи 1-2 степени, в связи с чем была возобновлена иммуносупрессивная терапия, однако полного разрешения поражения кожи до настоящего времени не достигнуто. Общая продолжительность клиникогематологической ремиссии ОМЛ составила 48 мес. Обсуждение Диагностика и лечение форм ОМЛ с недостаточным ответом на программную полихимиотерапию представляет собой серьезную проблему в клинической онкогематологии, т. к. их частота в группе взрослых пациентов достигает 60%, а у больных пожилого и старческого возраста - 80-90% [1, 6, 15]. С одной стороны, наличие специфических молекулярных и цитогенетических предикторов позволяет прогнозировать низкую эффективность ответа ОМЛ на лечение, с другой, эффективные таргетные препараты для лечения ОМЛ с хромосомными и генными мутациями, ассоциированными с неблагоприятным прогнозом, пока не разработаны, поэтому в качестве основной лечебной опции используется аллогенная трансплантация костного мозга, хотя и ее эффективность вне первой ремиссии лейкоза невысока [3, 4]. В описанном наблюдении в дебюте заболевания был определен анеуплоидный кариотип 48, XX, +4, +21 [2]/47, ХХ, +4 [3]/46, ХХ [2], а методом прямого секвенирования были выявлены несинонимичные замены с. 2447 A>T в гене с-KIT и с. 2644 С>Т в гене DNMT3A. Известно, что при ОМЛ мутации гена DNMT3A могут кооперироваться с инсерциями экзона 12 гена NPM1 и внутренними тандемными дупликациями (ITD) в гене FLT3, и более чем в 60% случаев они представлены гетерозиготными заменами, затрагивающими кодон R882 [7, 1 1]. Основным следствием этих мутаций на эпигенетическом уровне является гипометилирование специфических CpG-динуклеотидов и генома в целом [11, 12]. Именно одна из таких онкоген-ных мутаций и была обнаружена в нашем наблюдении. При этом инсерций в гене NPM1 методом секвенирова-ния выявлено не было. Кроме того, в пробе определялась патогенетически значимая трансверсия в гене c-KIT [16]. Соответственно, несмотря на достижение первой ремиссии после первого курса индукционной химиотерапии и неуточненный мутационный статус гена FLT3, вероятность рецидива ОМЛ оставалась крайне высокой. По данным литературы, аллогенная трансплантация костного мозга не оказывает положительного эффекта на общую выживаемость у больных ОМЛ при сочетании мутаций в генах DNMT3A и FLT3, однако может улучшать прогноз при изолированном повреждении кодона R882 DNMT3A [17]. В нашем наблюдении у больной молодого возраста с двумя патогенетически значимыми мутациями в генах DNMT3A и c-KIT и анеуплоидным кариотипом была достигнута стойкая продолжительная ремиссия ОМЛ за счет использования двойной гапло-идентичной трансплантации костного мозга. Общая продолжительность ремиссии составила 48 мес., что свидетельствует о возможности применения такого подхода при лечении ОМЛ у больных в молодом возрасте. Выводы 1. Выявлена кооперация мутаций в генах DNMT3A, c-KIT и аберрантного анеуплоидного кариотипа в онкогенезе острого миеломонобластного лейкоза у больной молодого возраста. 2. Онкогенный потенциал выявленных генных мутаций был подтвержден методом компьютерного моделирования с использованием распределенной сети предсказания структуры белка, что позволило персонифицировать пациентке неблагоприятный генетический прогноз. 3. Применение интенсивной полихимиотерапии, включавшей высокодозный цитарабин с даунорубици-ном, и последующей двойной гаплоидентичной трансплантации костного мозга позволило достичь у больной молодого возраста стойкой первой ремиссии, сохранявшейся на протяжении 48 мес. наблюдения.

About the authors

A. V Vinogradov

Ural State Medical University; Sverdlovsk Regional Clinical Hospital N 1

Email: a.vinogradov@egov66.ru

D. V Izotov

Ural State Medical University

A. V Rezaykin

Ural State Medical University

I. V Anisimova

Sverdlovsk Regional Clinical Hospital N 1

T. S Konstantinova

Ural State Medical University; Sverdlovsk Regional Clinical Hospital N 1

A. V Kudryashova

Sverdlovsk Regional Clinical Hospital N 1

S. V Sazonov

Ural State Medical University; Institute of Medical Cell Technologies

A. G Sergeev

Ural State Medical University

References

Supplementary files