KRIOKONSERVATsIYa TKANI PUPOVINY ChELOVEKA: RAZRABOTKA BEZOPASNOGO I EFFEKTIVNOGO PROTOKOLA

Abstract

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ. Пупочный канатик является источником уникальных по своим свойствам мультипотентных стромальных клеток (МСК), однако доступ к нему открыт лишь однажды, сразу после рождения ребенка. Крупнейшие биобанки мира активно предлагают услуги криоконсервации ткани пуповины с целью выделения из неё аутогенных клеточных культур при возникновении необходимости в будущем. Безопасность клеточных трансплантатов во многом зависит от используемых протоколов криоконсервации и экспансии культур, при этом в большинстве протоколов используются ксеногенная сыворотка крови и потенциально токсичный диметилсульфоксид (ДМСО). ЦЕЛЬ. Разработка эффективного протокола криоконсервации ткани пуповины, отвечающего xeno-free и DMSO-free стандартам. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Пуповину человека (n = 10) получали при проведении родоразрешения путём операции кесарева сечения. Материал отмывали от крови, нарезали на диски толщиной 5 мм и помещали в криопротекторную среду. Использовали два типа криопротекторной среды: (1) эмбриональная телячья сыворотка с добавлением сахарозы до 0,5М и ДМСО до 10%, (2) фосфатно-солевой буфер рН 7,4 с добавлением сахарозы до 0,5М, глицерина до 20% и альбумина человека до 35 г/л. Материал охлаждали до -70°С со скоростью 1°С/мин. и переносили в криохранилище. Сравнение эффективности протоколов проводили через 1-2 нед. хранения. Сохранность жизнеспособности клеток оценивали с помощью МТТ-теста на макропрепаратах и окрашивания кальцеином-АМ и иодидом пропидия на поперечных криосрезах. Выделение первичных клеточных культур проводили методом эксплантов с предварительной ферментативной обработкой ткани. Принадлежность выделенных культур к МСК оценивали с помощью анализа иммунофенотипа и индукции направленной дифференцировки in vitro. РЕЗУЛЬТАТЫ. Оба используемых протокола обеспечивали сохранность архитектоники ткани пуповины после размораживания и выживаемость всех типов клеток: однослойного амниотического эпителия, стромальных клеток субамниотической, интерваскулярной и периваскулярной области, клеток стенок кровеносных сосудов и эндотелия. Эффективность выделения первичных клеточных культур из вартоно-ва студня составила 100%. Клетки имели соответствующий МСК профиль экспрессии поверхностных антигенов CD73 + , CD90 + , CD105 + , CD45-, CD34-, CD 11 b-, CD19-, HLA-DR- и отвечали на действие индукторов дифференцировки в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Разработанный протокол криоконсервации ткани пуповины человека без использования ксеногенных компонентов и ДМСО обеспечивает сохранность жизнеспособных клеток в ткани и возможность получения культур мультипотентных стромальных клеток. Использование протоколов, соответствующих xeno-free и DMSO-free стандартам, необходимо для обеспечения качества полученных из криоконсервированной ткани клеточных культур, предназначенных для трансплантации.