Poluchenie ipsk s kol'tsevymi khromosomami i analiz ikh stabil'nosti v somaticheskikh i plyuripotentnykh kletkakh

Abstract

Full Text

Кольцевые хромосомы возникают вследствие слияния двух концов одной хромосомы и отличаются повышенной митотической нестабильностью. Интерес к поведению кольцевых хромосом in vitro возрос в связи с новыми данными о том, что плюрипотент-ные клетки с кольцевыми хромосомами могут быть терминальными и неделящимися [Bershteynet al., 2014]. Механизм эффективного избавления от кольцевой хромосомы в ИПСК мог бы стать основой для разработки универсального метода коррекции хромосомных дефектов, для чего необходим анализ «поведения» кольцевых хромосом в плюрипотентных клетках. Материал был получен от двух пациентов с кариотипами 46,XY(r13) и 46,XX(r22). С помощью FISH с центромероспецифичными зондами и зондами на дистальную область длинного плеча хромосом 13 и 22 изучено соотношение клонов клеток с кольцевой хромосомой и с ее потерей в различных клеточных популяциях (лимфоциты периферической крови, первичные линии фибробластов и линии ИПСК). Мозаичные моносомии с потерей кольцевой хромосомы выявлены в 39% и 8% лимфоцитов у пациентов с r13 и r22 соответственно. При культивировании фибробластов динамика кариотипов отличалась между линиями: в фибробластах с r22 доля моносомных клеток постепенно возрастала (с 24% на П1 до 42% на П33 (2 = 6,649, P<0,05)), тогда как в фибробластах с r13 направленных изменений не выявлено (50% на П2, 41% на П5, 38% на П7 и 56% на П9). В фибробластах с r13 на 5-9 пассажах отмечена весьма высокая частота микроядер (МЯ) с наличием центромерного сигнала 13/21, равная 3,3%, причем в 1,4% клеток МЯ содержали по 2 сигнала, что, скорее всего, соответствует отставанию обеих хроматид кольцевой хромосомы. Линии ИПСК были получены из фибробластов путем экзогенной экспрессии транскрипционных факторов KLF4, OCT4, SOX2 и с-MYC человека с использованием лентивирусных векторов LeGO. Получены 2 клона с r22 и 3 клона с r13, морфологически соответствующие ИПСК, подтверждение их плюрипотентности проводится. Показано, что на ранних пассажах клетки с кольцевой хромосомой сохранились в качестве модального класса во всех полученных клонах ИПСК: 87% на П11 и 94% на П9 в двух клонах с r22; 90% на П5, 86% на П7, 87% на П5 в трех клонах с r13. Это говорит об относительной стабильности кольцевых хромосом 13 и 22 в плюри-потентных клетках. Для определения частоты потери и замещения кольцевой хромосомы в ИПСК планируется провести субклонирование.