Vliyanie urokinazy i urokinaznogo retseptora na funktsional'noe sostoyanie tsitototoksicheskikh t-limfotsitov IN VIVO

Abstract

Full Text

Система активаторов плазминогена урокиназно-го типа, или урокиназная система, включает в себя сериновую протеазу урокиназу (uPA), урокиназный рецептор (uPAR) и ингибиторы (PAI1 и PAI2). Уро-киназная система осуществляет запуск каскадов внеклеточного протеолиза и внутриклеточной сигнализации, опосредуя миграцию, пролиферацию и выживаемость клеток. В нескольких работах была показана важная роль урокиназной системы в регуляции адаптивного иммунного ответа, в частности, в регуляции активности Т-хелперных лимфоцитов первого (Gyetkoetal 2002, PMID:11777975) и второго (Gyetkoetal 2004, PMID:14688127) типов, а также в активации регуляторных Т-лимфоцитов (Heetal 2012, PMID:23169000). Несмотря на эти данные, молекулярные механизмы участия uPA и uPAR в регуляции иммунного ответа до конца не изучены; кроме того, недостаточно данных о влиянии uPA и uPAR на цито-токсические (CD8 + ) Т-лимфоциты, которые обеспечивают клеточный цитотоксический иммунный ответ, а также участвуют в патогенезе посттрансплантаци-онных осложнений и аутоиммунных заболеваний. Целью данной работы стала оценка влияния uPA и uPAR на функционирование CD8+ лимфоцитов мыши. В работе использовали мышей нескольких линий: нокаутированных по гену урокиназного рецептора (линия uPAR-KO), нокаутированных по гену урокиназы (линия uPA-KO), а также линии мышей дикого типа (WT). Суспензию белых клеток селезенки получали по стандартному протоколу, после чего окрашивали c использованием антител, специфичных к CD8a. Анализ окрашивания проводили методом проточной цитометрии. Оценку уровня экспрессии CTLA-4 (молекулы, экспрессируемой активированными Т-лимфоцитами и ингибирущей их пролиферацию) на уровне мРНК осуществляли методом ПЦР в режиме реального времени. Для этого CD8+ лимфоциты выделяли из суспензии белых клеток селезенки на клеточном сортере (FACSAria, BDBiosystems), после чего из CD8+ лимфоцитов выделяли тотальную РНК. Нами было обнаружено, что у uPAR-KO мышей (в возрасте 8 нед.) наблюдается повышенное содержание CD8 + клеток в селезенке по сравнению с мышами дикого типа (9,84±0,2 млн у uPAR-KO, 4,07±0,28 млн у WT). Однако в более молодом возрасте (2 нед.) содержание CD8+ клеток у животных дикого типа и uPAR-KO мышей статистически не различается (0,75±0,06 млн у uPAR-KO, 0,82±0,14 млн у WT). Анализ содержания мРНК Ctla4 показал, что у uPAR-KO мышей (в возрасте 8 нед.) его экспрессия в 2,9 раза ниже по сравнению с мышами WT. У uPA-KO мышей в возрасте 8 недель также наблюдается повышенное содержание CD8+ лимфоцитов по сравнению с контрольными животными (5,72±0,89 млн у uPA-KO, 1,46±0,44 млн у WT). Экспрессия гена Ctla4 в субпопуляции CD8+ лимфоцитов у uPA-KO мышей по сравнению с WT мышами также снижена в 4,04 раза. Полученные данные позволяют предположить, что отсутствие экспрессии урокиназы и урокиназного рецептора повышают пролиферацию CD8+ Т-лимфоцитов. В обоих случаях это происходит по механизму, связанному c изменением уровня экспрессии гена Ctla4.