Optimizatsiya i standartizatsiya prigotovleniya monosloynykh kul'tur stvolovykh kletok iz tkaney glaza, kak biomeditsinskikh kletochnykh produktov, s tsel'yu ikh ispol'zovaniya v oftal'mologii

Abstract

Full Text

В настоящее время актуальной проблемой в офтальмологии является лечение заболеваний роговицы глаза, для чего требуется выполнение реконструктивных вмешательств с использованием донорских тканей. Высокая частота отторжения трансплантатов побуждает к поиску альтернативных методов лече Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 116 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине ния. В последние годы большой интерес вызывают специализированные стволовые клетки, локализованные в ткани лимба и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), находящиеся в окружающих глаз тканях. Экспериментальные доклинические и клинические исследования показали их эффективность в клеточной терапии повреждений роговицы глаза. В настоящее время описан ряд методик приготовления культур клеток глаза, отличающихся способами их выделения и условиями культивирования. Целью исследования явилась отработка технологии выделения и накопления in vitro биомассы стволовых клеток глаза, используемой для приготовления биомедицинского клеточного продукта и его применения для регенерации роговицы. На первом этапе исследований проведено определение оптимальных условий приготовления первичных монослойных культур стволовых клеток из биопсийных образцов лимба и жировой ткани орбиты глаза (ЖТ ОГ) пациентов и проведена сравнительная оценка роста клеток на ростовых средах различного состава. Критерием оценки жизнеспособности клеток на этапе получения первичной культуры служила эффективность колониеобразования, а на последующих пассажах - время удвоения клеточной популяции с сохранением эпителиоподобной (в случае клеток лимба) или фи-бробластоподобной морфологии - в случае клеток ЖТ ОГ. В качестве способа культивирования клеток использовали метод эксплантов. Миграция пролиферативно-активных клеток из эксплантов проявлялась: из ткани лимба на 3-5 сут, а из ЖТ ОГ - на 5-7 сут. Для приготовления культур стволовых клеток лимба (СКЛ) была выбрана среда DМЕМ/ F12 с добавлением эпидермального фактора роста (ЭФР) и 5% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). Установлено, что при разных концентрациях ЭФР (5-10 нг/мл) наблюдается различное время удвоения СКЛ (от 48 до 56 ч.). Способность СКЛ формировать колонии в зависимости от используемой концентрации ЭФР меняется в 1,7 раза. Популяция культивированных клеток ткани лимба была представлена стволовыми клетками и клетками предшественниками эпителия (нестин+, цитокератин - 14+,16 + , 19 + ). Для культивирования клеток из ЖТ ОГ использовали среду DМЕМ с 10% ЭТС. Популяция клеток ЖТ ОГ была представлена преимущественно МСК (CD44+/CD73+/CD90+/CD105+/ CD34-/CD45-). Выделение стволовых и прогениторных клеток глаза из небольшого объема биопсийного материала глаза и наработка их биомассы сопряжена с определенными сложностями. Решение задачи определяют: метод эксплантов, состав ростовой среды, обеспечивающие жизнеспособность клеток и формирование крупных колоний эпителиоподобных (ткань лимба) или фибробластоподобных (ЖТ ОГ) клеток.