RAZRABOTKA I PRIMENENIE MALOGABARITNOGO BIOREAKTORA DLYa FORMIROVANIYa KhRYaShchEVOY TKANI ChELOVEKA

Abstract

Full Text

В регенеративной медицине для создания in vitro тканеинженерных конструкций хрящевой ткани человека (ТИК ХТч) используют различного типа биореакторы - многокомпонентные аппаратные системы, обеспечивающие необходимые условия для дифференцировки и пролиферации клеток с последующим формированием тканевых структур при их культивировании на 2D- или 3D-биосовместимых биостабильных или резорбируемых матриксах. Перфузионные биореакторы, по сравнению с другими системами, более эффективно обеспечивают транспорт питательных веществ и газов к клеткам, а также выведение от них продуктов обмена веществ, имитируя физиологические условия для формирования тканевого эквивалента. Кроме того, замкнутая система проточного биореактора позволяет обеспечить стерильность. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - разработка и апробирование компактного перфузионного биореактора с четырьмя культуральными камерами для формирования ТИК ХТч. Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 40 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Биореактор включал в себя две системы циркуляции. В каждой из них к резервуару с культуральной средой параллельно подключали две камеры. На пористую нижнюю часть культуральных камер помещали подложку, мембрану («MerckMilliporeLtd.», Ирландия), которая удерживала матрикс, биополимерный микроструктурированный коллагенсодержащий гидрогель (БМКГ) (АО «Биомир сервис», г. Краснознаменск), с мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека (МСК ЖТч). Биореактор помещали в СО2-инкубатор. Выбор материала для подложки был сделан на основании оценки цитотоксичности и матриксных свойств на фибробластах мыши линии 3Т3, а оптимальный размер пор в ней по величине создаваемого давления в биореакторе, заполненного модельным раствором. Клеточно-инженерные конструкции (КИК) ХТч первые сутки культивировали в ростовой среде MesenPRORS™ (Gibco® byLifeTechnologies™, США), затем помещали в проточный биореактор при скорости 0,5 мл/мин и объеме циркулирующей среды 110 мл. Через сутки ростовую среду заменяли на индукционную хондро-генную STEMPRO® (Gibco® byLifeTechnologies™, США). Жизнеспособность клеток оценивали методом флуоресцентного окрашивания «Live/Dead» («In vitrogen», США). Морфологическое исследование проводили, используя методы гистологического окрашивания. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В качестве материала подложки для КИК выбрали нейлон, проявляющий биологическую инертность, так как поликарбонат, обладающий матриксными свойствами, мог бы повлиять на развитие КИК. Мембрана с размером пор 10 мкм создавала меньшее давление в системе, чем подложка с размером пор 5 мкм, и была выбрана для дальнейших экспериментов. Через 16 дней эксперимента наблюдали прогрессивное нарастание клеточной массы со значительным образованием внеклеточного матрикса (ВКМ), причем форма клеток изменилась до уплощенной и вытянутой, а соотношение клеток и ВКМ поменялось в пользу последнего. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. МСК ЖТч в БМКГ проявили высокую пролиферативную активность с формированием собственного ВКМ, что указывает на перспективность префузионного биореактора для создания ТИК ХТч.