Induction of capacitation of bovine spermatozoa before cryopreservation increases their viability after thawing

Full Text

Введение Криоконсервация спермы является важным инструментом репродуктивной биотехнологии, но процессы замораживания-размораживания оказывают на сперматозоиды негативное влияние, которое изучено в недостаточной степени [1]. Было показано, что процедуры, производимые при криоконсервации (разбавление спермы, охлаждение, замораживание-размораживание) индуцируют в сперме процессы, аналогичные тем, которые происходят в ней при капацитации, в частности, можно отметить реорганизацию плазматической и акросомной мембран, вход кальция в сперматозоиды [2, 3]. Также было обнаружено, что в основном изменение функционального статуса криоконсервированных сперматозоидов аналогично изменению функционального статуса сперматозоидов при капацитации: они способны подвергаться акросомной реакции или оплодотворять оо-циты in vitro [4, 5]. Несмотря на то, что молекулярные механизмы капацитации выяснены не полностью, в многочисленных исследованиях выявлено, что при капаци-тации происходят изменения в составе и текучести мембран сперматозоидов [6]; увеличивается концентрация Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 73 цитоплазматического кальция [7]; возрастают цитоплазматический рН [8] и концентрация cAMP [9]. Также ка-пацитация зависит от уровня содержания внеклеточного кальция и подъем уровня внутриклеточного Ca2+ является необходимым условием для ее успешного протекания [5]. В настоящее время основным направлением в совершенствовании методов криоконсервации мужских гамет, которые могут повысить выход жизнеспособных сперматозоидов после замораживания-размораживания, является улучшение качества криосред путем подбора криопротекторов для снижения губительного влияния сверхнизких температур. Однако, результаты, получаемые при этом, достаточно скромные. Известно, что подвижность спермы крупного рогатого скота сразу же после размораживания зачастую не коррелирует с фертильностью гамет [10]. Несмотря на сохранение адекватной подвижности, криоконсервированная сперма имеет значительные нарушения мембраны [1]. Повышение уровня внутриклеточного кальция в крио-консервированной сперме и её пониженная способность поддерживать нормальную концентрацию этого катиона может являться одним из объяснений снижения оплодотворяющей способности спермы после размораживания [11]. Небольшое количество (~6 %) холестерола стабилизировано в цитоплазматической мембране спермиев в виде сульфатов. В процессе движения гамет по женскому репродуктивному тракту стеролсульфатазы инициируют гидролиз сульфатных групп, увеличивая пул холестерола, доступного для этерификации. Таким образом в процессе капацитации осуществляется перестройка липидного состава цитоплазматической мембраны сперматозоидов путем выхода из ее состава определенного количества холестерола, являющегося мощным фактором, стабилизирующим мембрану. Связываясь с мембранными фосфолипидами, холестерол увеличивает плотность упаковки мембраны и, тем самым, снижает ее текучесть и проницаемость. В процессе криоконсервации происходит повреждение мембран спермиев кристаллами льда, что приводит к неконтролируемым изменениям проницаемости для различных ионов. Как следствие, затрудняется нормальный ход капацитации после размораживания, что демонстрирует появление «ложной» капацитации в размороженных образцах сперматозоидов [12]. В соответствии с вышесказанным, можно предположить, что индукция капацитации, осуществляемая перед криоконсервацией, позволит избежать этих процессов. Целью исследования являлся анализ показателей жизнеспособности размороженных сперматозоидов быков после индуцированной капацитации с последующей криоконсервацией. Материал и методы Дизайн эксперимента Эякулят от неинбредных быков айрширской (n=1 ) и черно-пестрой пород (n=2) получали в день эксперимента. При проведении исследований соблюдались правила гуманного обращения с экспериментальными животными, регламентированные «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ РФ № 267 от 19.03.2003 г.). После обработки образцов спермы и капацитации производили криоконсервацию с последующей оценкой функционального состояния и жизнеспособности сперматозоидов. Для оценки влияния капацитации на функциональный статус сперматозоидов и их жизнеспособность было поставлено 2 серии экспериментов в 4 группах: 1 группа - инкубация в среде для спермы быков в течение 4 ч.; 2 группа - инкубация в среде для спермы быков в течение 4 ч., в которую добавляли гепарин (5 мкг/мл); 3 группа - инкубация в среде для спермы быков в течение 4 ч., в которую добавляли теофиллин/dbcAMP (250/100 мкМ); 4 группа - контроль - клетки без инкубации. Первая серия экспериментов была проведена на клетках, которые не замораживали, вторая серия - на клетках, которые криоконсервировали после процедуры капацитации и через 1 сут. размораживали. В работе использовали реактивы компании Sigma-Aldrich (США): инкубационную среду TALP, поливинил-алкоголь, хлортетрациклин (ХТЦ), бычий сывороточный альбумин, глутаральдегид, L-цистеин, 1,4-диазобицикло [2.2.2]-октан, глицерол, гепарин, теофиллин, dbcAMP Приготовление образцов спермы От каждого быка было получено 5 образцов спермы. Для освобождения от семенной плазмы сперму два раза отмывали средой SP-TALP, состоящей из: 100 мМ NaCl, 3,1 мМ KCl, 25 мМ NaHCO3, 0,3 мМ NaH2PO4, 21,6 мМ лактата натрия, 0,4 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата и 0,1 % поливинилалкоголя (молекулярной массой 30 000-70000 Да), pH 7,4, с последующим центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. Процедура капацитации Для капацитации использовали среду Sp-TALP, в которую было добавлено 6 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 0,5 мМ CaCl2 (среда для спермы быков). Активацию капацитации в клетках проводили с помощью гепарина (5 мкг/мл) или смесью теофиллина и dbcAMP (250 и 100 мкМ, соответственно). Продолжительность капацитации сперматозоидов составляла 4 ч. при 38,5 °С, 95 % влажности и 5 % СО2 Криоконсервация сперматозоидов Для криоконсервации сперматозоидов образцы семени разбавляли в два раза средой для спермы быков, не содержащей яичного белка (Andromed, Minitube, Германия), доводили температуру семени до 20-22 °С, фасовали в пайеты и выдерживали в течение 3-4 ч. в холодильнике при температуре 4 °С. Далее образцы семени охлаждали в течение 7,5 мин. до температуры -145 °С в программном замораживателе, а затем помещали в жидкий азот, где они хранились при температуре -196 °С. Размораживание образцов биологического материала проводили на водяной бане при 38,5 °С в течение 1 мин. Объем биологического материала составлял 200 мкл на пробу. Оценка влияния капацитации на функциональное состояние сперматозоидов После капацитации 20 мкл суспензии сперматозоидов смешивали с 20 мкл раствора ХТЦ и инкубировали при 38,5 °С в течение 10 мин. Раствор ХТЦ (750 мкМ) готовили в буфере, который содержал 130 мМ NaCl, 5 мМ L-цистеина, 20 мМ Трис (рН 7,8). Для фиксации добавляли 10 мкл 25 % глутаральдегида в 1 мМ Трис. (рН 7,4) до конечной концентрации 0,1 %. При этой концентрации глутаральдегида флуоресценция оставалась стабильной в течение 2 ч. и не оказывала дополнительного влияния на клетки [13]. После этого при комнатной температуре каплю суспензии сперматозоидов (10 мкл) размещали на предметном стекле, смешивали с 10 мкл 0,22 М 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана, растворенного в глицерол/PBS (9:1, v/v), накрывали покровным стеклом и хранили в темноте при 4 °С. С помощью окуляра Levenhuk 10x/18 с сеткой (Levenhuk, Китай) Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 74 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ в поле зрения отсчитывали 200 сперматозоидов и анализировали под люминесцентным микроскопом Zeiss Axio Imager (Германия) с фазовым контрастом и эпифлуорес-центной оптикой (возбуждение при 400-440 нм и излучение при 470 нм) [12]. Сперматозоиды оценивали в соответствии с одним из трех типов флуоресцентного окрашивания ХТЦ [14]: равномерная флуоресценция по всей головке (некапацитированные клетки, образцы F), свободная от флуоресценции полоса в постакросо-мальном районе (капацитированные клетки, образцы В), низкая флуоресценция по всей головке, за исключением тонкой яркой полосы флуоресценции в экваториальном сегменте (акросома-реактивные клетки, образцы AR). Оценка жизнеспособности сперматозоидов Жизнеспособность сперматозоидов оценивали с использованием красителя пропидиума йодида (PI). Клетки отмывали от криопротектора дважды средой Sp-TALP с последующим центрифугированием при 600 g в течение 10 мин., окрашивали раствором PI (5 мкг/мл) и анализировали сразу под люминесцентным микроскопом Zeiss Axio Imager (возбуждение при 540 нм, излучение при 625 нм; Германия). Живые сперматозоиды имели слабо флуоресцирующую головку, мертвые - яркую флуоресценцию по всей головке. Статистический анализ В связи с параметрическим распределением количественных показателей сравнение групп осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента с использованием программного пакета SigmaStat. Результаты В экспериментах на сперматозоидах быков изучали влияние капацитации на структурные изменения в мембране клеток с использованием флуоресцентного зонда ХТЦ, который образует комплексы в присутствии кальция (ХТЦ-кальций-мембрана), что позволяет сделать видимым перераспределение кальция в мембране сперматозоидов [1 4]. В 1 серии экспериментов после проведения капацитации сперматозоиды не замораживали (рис. 1 ). В образцах, инкубированных в среде без добавок по сравнению с образцами без инкубации (контроль) отмечали снижение процентного содержания (на 30 %) некапацитированных клеток (образцы F). Аналогичный эффект наблюдали при капацитации сперматозоидов в присутствии гепарина, а также теофиллина/dbcAMP. В то же время инкубация образцов спермы в среде без добавок приводила к увеличению количества капаци-тированных клеток в 3 раза (P<0,001, образцы B), наибольшее количество капацитированных сперматозоидов (увеличение в 4 раза, P<0,001 ) отмечали тогда, когда при инкубации добавляли в среду гепарин или теофиллин совместно с dbcAMP. Во 2 серии экспериментов изучали влияние предварительной капацитации сперматозоидов перед замораживанием на структурные изменения в мембране сперматозоидов быков после размораживания (рис. 2). В отличие от сперматозоидов, которые не замораживали, после замораживания-размораживания процентное содержание некапацитированных клеток (образцы F) оставалось одинаковым (20-24 %) во всех опытных группах. Наибольший процент (54±2,36, P<0,001) капацитирован-ных клеток (образцы B) отмечали в контрольных образцах, которые перед замораживанием не инкубировали. Предварительная инкубация сперматозоидов перед замораживанием приводила к снижению процента капаци-тированных клеток (в 2 раза) (образцы B) и к повышению процентного содержания акросома-реактивных клеток (образцы AR) в размороженных сперматозоидах во всех опытных группах. Полученные данные свидетельствуют, что предварительная капацитация сперматозоидов быков перед замораживанием стимулирует в размороженных клетках снижение количества капацитированных и повышение числа акросома-реактивных клеток. При оценке влияния процесса капацитации на жизнеспособность интактных сперматозоидов быков были обнаружены сходные показатели соотношения живых и мертвых клеток (3:1) в контроле и в образцах, инкубированных в среде без добавок (рис. 3). Активация ка-пацитации гепарином, а также теофиллином и dbcAMP, не приводила к изменению количества жизнеспособных клеток по сравнению с контролем и образцами, инкубированными в среде без добавок. Таким образом, активация процессов капацитации не оказывала влияние на жизнеспособность интактных сперматозоидов быков. Результаты экспериментов по влиянию предварительной капацитации (до замораживания) на жизнеспособность замороженных/размороженных сперматозоидов быков, представлены на рис. 4. В контрольных образцах (без инкубации) после размораживания сперматозоидов соотношение живых/мертвых клеток составляло примерно 1:1. Инкубация образцов в среде без добавок до замораживания не приводила к значительным изменениям в соотношении живых/мертвых клеток по сравнению с контролем. В то же время инкубация до замораживания сперматозоидов в присутствии гепарина, а также теофиллина и dbcAMP, увеличивала количество жизнеспособных сперматозоидов после размораживания в 2 раза. Обсуждение Криоконсервация спермы широко используется в промышленном разведении крупного рогатого скота, однако половина из замороженных сперматозоидов не выживает, а в большинстве из тех, которые выживают, происходят функциональные изменения, влияющие на их способность к оплодотворению. Было обнаружено, что в криоконсервированной сперме быков сразу после размораживания и отмывания почти 50 % сперматозоидов завершили капацитацию и более 20 % находились на стадии акросомной реакции [15]. Исходя из этих данных, для достижения эквивалентной степени оплодотворения количество криоконсервированных сперматозоидов крупного рогатого скота должно быть в 8 раз больше по сравнению со свежей спермой [16]. Оплодотворяющая способность после размораживания значительно снижается из-за преждевременной капацитации. После разморозки сперматозоидов быков отмечается высокий процент клеток на стадии капацитации, и чем их больше, тем хуже качество образца [12]. Существует гипотеза, согласно которой криоконсервированные сперматозоиды преждевременно «капацитируют» сразу после размораживания в результате эффекта сверхнизких температур: повреждения, полученные клеткой во время криоконсервации, достаточны для «облегчения» и/или стимуляции функциональной капацитации сперматозоидов. Повреждающее действие сверхнизких температур при криоконсервации, прежде всего, направлено на плазматическую мембрану сперматозоидов [17]. Было показано, что воздействие на сперму кабана сверхнизких температур с последующим размораживанием клеток вызывало деструкцию плазматических мембран средней части и головки сперматозоидов [18]. После криоконсервации размороженная сперма человека и быков содержала большее количество внутриклеточного кальция, Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 75 рис. 1. Влияние капацитации на функциональный статус незамороженных сперматозоидов быков: 1 - клетки без инкубации (контроль); 2 - клетки, инкубированные 4 ч. в среде без добавок; 3 - клетки, инкубированные 4 ч. в присутствии гепарина; 4 - клетки, инкубированные 4 ч. в присутствии теофиллина и dbcAMP. По оси ординат - процентное содержание клеток с разным функциональным статусом: некапацитированные клетки (образцы F); капацитированные клетки (образцы В); акросома-реактивные клетки (образцы AR). Статистическая значимость различий: a:b; b:c; a:j; b:h; e:h; b:k - P<0,001; a:g; b:h - Р<0ДО5; a:c; a:d; e:k - P<0,05 рис. 2. Влияние предварительной капацитации сперматозоидов быков перед заморозкой на капацитацию клеток после криоконсервации: 1 - клетки без инкубации (контроль); 2 - клетки, инкубированные 4 ч. в среде без добавок; 3 - клетки, инкубированные 4 ч. в присутствии гепарина; 4 - клетки, инкубированные 4 ч. в присутствии теофиллина и dbcAMP. По оси ординат - процентное содержание клеток с разным функциональным статусом: некапацитированные клетки (образцы F); капацитированные клетки (образцы В); акросома-реактивные клетки (образцы AR). Статистическая значимость различий: a:b; b:c; g:i; h:i; j:l; k:l; b:c; b:h; b:k; c:i; c:l - P<0,001; d:f; c:f - P<0,005; e:f - P<0,05 рис. 3. Влияние капацитации на жизнеспособность незамороженных сперматозоидов быков: 1 - клетки без инкубации (контроль); 2 - клетки, инкубированные 4 ч. в среде без добавок; 3 - клетки, инкубированные 4 ч. в присутствии гепарина; 4 - клетки, инкубированные 4 ч. в присутствии теофиллина и dbcAMP. По оси ординат - процентное содержание клеток. Статистическая значимость различий: a:b; ad; e:f; g:h - P<0,001 рис. 4. Влияние предварительной капацитации сперматозоидов быков перед заморозкой на жизнеспособность клеток после криоконсервации: 1 - клетки без инкубации (контроль); 2 - клетки, инкубированные 4 ч. в среде без добавок; 3 - клетки, инкубированные 4 ч. в присутствии гепарина; 4 - клетки, инкубированные 4 ч. в присутствии теофиллина и dbcAMP. По оси ординат - процентное содержание клеток. Статистическая значимость различий: e:f; g:h - P<0,001; a:e; b:f; a:g; b:h - P<0,005; c:e; d:f; c:g; d:h - P<0,05 что свидетельствует о нарушении мембранных механизмов избирательной проницаемости [11, 19]. Таким образом, если плохое качество материала связано с большим количеством капацитированных клеток после размораживания, можно предположить, что уменьшение количества капацитированных клеток после размораживания сперматозоидов позволит улучшить их качество. Ранее было выявлено, что обработка сперматозоидов быков высокодисперсным кремнеземом перед замораживанием приводила после размораживания клеток к повышению подвижности спермы, увеличению показателей выживаемости клеток и стабилизации их мембран [20]. При инкубации сперматозоидов быков в течение 4 ч. в присутствии 0,001 % высокодисперсного кремнезема без последующего замораживания отмечали увеличение количества капацитированных клеток [21]. Было сделано предположение, что одним из факторов, способствующих лучшему переживанию сперматозоидами замораживания, является активация высокодисперсным кремнеземом процессов капацитации в сперматозоидах. Для проверки этого предположения было изучено влияние гепарина на сохранность сперматозоидов после замораживания-размораживания. Было обнаружено, что инкубация перед криоконсервацией сперматозоидов быков в течение 4 ч. в присутствии гепарина приводила к снижению количества капацитированных клеток после их размораживания. В то же время инкубация Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 76 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ сперматозоидов, которые не подвергались последующему замораживанию, в присутствии гепарина стимулировала увеличение количества капацитированных клеток [22]. Следовательно, предварительная капацитация сперматозоидов быков перед замораживанием позволяет уменьшить процент капацитированных клеток после размораживания, что, по-видимому, может способствовать улучшению качества мужских гамет. Известно, что при связывании с рецепторами сперматозоидов гепарин стимулирует подъем концентрации внутриклеточного кальция, рН и cAMP [23]. Влияние cAMP на капацитацию сперматозоидов быков было изучено с использованием теофиллина и dbcAMP, которые в этих клетках стимулируют увеличение внутриклеточной концентрации cAMP. Оказалось, что предварительная капацитация сперматозоидов перед замораживанием с помощью теофиллина и dbcAMP, так же, как и при действии гепарина, приводила к уменьшению процента ка-пацитированных клеток после размораживания. Из вышесказанного следует, что стимулированная гепарином предварительная капацитация сперматозоидов перед замораживанием, приводящая впоследствии к снижению количества капацитированных клеток после размораживания, связана с повышением концентрации внутриклеточного cAMP во время капацитации. В предыдущем исследовании нами было установлено, что после размораживания в сперматозоидах быков повышается количество капацитированных клеток и понижается число жизнеспособных сперматозоидов. Если же перед замораживанием провести процедуру капа-цитации сперматозоидов, то после размораживания количество капацитированных клеток снижается [24]. Можно было ожидать, что предварительная капацитация перед заморозкой также приведет к повышению числа жизнеспособных сперматозоидов после размораживания. Полученные в данной работе результаты показали, что после предварительной капацитации в присутствии гепарина, а также теофиллина и dbcAMP после замораживания/размораживания происходило значительное (P<0,001) увеличение количества жизнеспособных сперматозоидов. Выявленный эффект индуцирования капацитации в сперматозоидах быков до их криоконсервации на повышение количества жизнеспособных клеток после размораживания может быть использован при модернизации этапов технологии криоконсервации мужских гамет.

About the authors

V. Yu Denisenko

Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding - Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry

T. I Kuzmina

Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding - Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry

Email: prof.kouzmina@mail.ru

E. N Boytseva

Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding - Branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry

References

Supplementary files