The role of skeletal muscle tissue extracellular matrix components in myogenesis

Full Text

Введение Интенсивное развитие регенеративной медицины, в частности тканевой инженерии, обусловливает появление новых подходов к лечению заболеваний скелетной мускулатуры. В настоящее время установлено, что повреждения, сопряженные с объемной потерей поперечнополосатой скелетной мышечной ткани, не могут быть полностью восстановлены только за счет резидентных или трансплантированных клеток с высоким миогенным потенциалом (например, миосателлитоцитов) [1, 2]. В связи с этим, при помощи методов регенеративной медицины разрабатываются альтернативные стратегии индукции процессов репарации мышечной ткани, в частности с использованием тканеинженерных конструкций (ТИК), способных обеспечить эффективное замещение дефекта функциональной поперечнополосатой мышечной тканью [3]. Этот подход основан на получении и культивировании миогенных клеток, «заселении» ими природных или синтетических 3D-каркасов, играющих роль внеклеточного матрикса (ВКМ). Кроме опорной функции, немаловажное значение таких каркасов заключается в регуляции различных процессов жизнедеятельности клеток, например, выживания, миграции, пролиферации и диффе-ренцировки [4, 5]. Все это требует не только понимания биологии стволовых и (или) прогениторных клеток, но и изучения состава ВКМ, а также механизмов регенерации скелетной мышечной ткани и взаимодействия между клетками и матриксом [3]. Свойства клеток с миогенным потенциалом, в том числе немышечного происхождения, и особенности их участия в миогенезе подробно изложены в многочисленных работах [1, 2]. В настоящем обзоре представлены данные по структуре и составу основных компонентов ВКМ скелетной мышечной ткани и их роли в миогенной дифференцировке клеток in vitro и in vivo. Внеклеточный матрикс (ВКМ) ВКМ - это трехмерная сеть макромолекул, заполняющая пространство вокруг клеток в тканях и создающая механическую опору для них. Архитектоника и состав ВКМ, представляющего собой продукт секреции клеток, входящих в состав стромы, в каждой ткани являются уникальными, они же определяют функциональность этой ткани [6, 7]. Комплексная трехмерная организация каркаса ВКМ и его компонентов также зависит от ткани и является органоспецифичной [8, 9]. Тем не менее, структура и состав каждого конкретного белка ВКМ (коллагены различных типов, ламинин, фибронектин, эластин, гиалуроновая кислота), остаются неизменными у различных видов организмов и представлены в ВКМ большинства тканей [10]. В состав матрикса входят как структурные (коллагены, ламинин, эластин и др.), так и функциональные (матрикс-ные металлопротеиназы, матрилины, факторы роста и др.) молекулы, обеспечивающие межклеточную коммуникацию [11]. Его роль реализуется за счет модуляции многих клеточных функций различными способами, в том числе механической стимуляцией, которая достигается путем изменения степени жесткости матричных компонентов, непосредственно влияющих на дифференциров-ку клеток [11]. Помимо этого, компоненты ВКМ могут связывать и аккумулировать растворимые биологически активные факторы, тем самым регулируя их доступность и активность. Также белки ВКМ, взаимодействуя с молекулами адгезии, влияют на химическую и внутриклеточную сигнализацию, дифференцировку стволовых клеток [12]. Таким образом, ВКМ имеет ключевое значение в регуляции многих внутриклеточных процессов и межклеточного взаимодействия: пролиферации, адгезии, миграции, дифференцировки, экспрессии генов. Кроме Гены & Клетки Том XIII, № 4, 2018 18 ОБЗОРЫ того, ВКМ принимает участие в программируемой гибели клеток, стимулируя нарушение взаимодействия клетка-матрикс [13]. Следует отметить, что состав и структура ВКМ подвергаются постоянному ремоделированию за счет активности матрикс-деградируемых ферментов, синтезируемых клетками стромы, в частности, катепси-нов, гепараназы, гиалуронидазы и металлопротеаз [14]. Основные элементы внеклеточного матрикса скелетной мышечной ткани и их функции. ВКМ скелетной мышечной ткани состоит из интерстициального матрикса и базальной мембраны. Интерстициальный ВКМ заполняет пространство между мышечными волокнами и их пучками, а также поддерживает механическую целостность в местах перехода в сухожилия. В состав интерстициального ВКМ входит большое количество макромолекул, определяющих его свойства. Среди них выделяют белки, формирующие волокна, к типичным представителям которых относят коллаген, эластин, фибронектин, ламинин, и не формирующие волокон белки, такие как протеогликаны и гликозаминогликаны [6]. У млекопитающих репаративный гистогенез мышечной ткани в ответ на повреждение, как и в других тканях, состоит из нескольких последовательно сменяющих друг друга фаз [15-17]. На первом этапе происходит некроз клеток паренхимы, дегенерация стромы, образование гематомы, миграция клеток воспаления (макрофагов, преимущественно секреторного типа) в очаг повреждения и их активация [18]. В дальнейшем наблюдается активация покоящихся миогенных клеток-предшественниц - миосателлитоцитов [19, 20], которые вступают в клеточный цикл и мигрируют в область травмы. Впоследствии, в активированных сателлитных клетках запускается ми-огенная дифференцировка. Клетки-предшественницы сливаются с поврежденными волокнами или образуют новые миосимпласты. На этой стадии наблюдается локальная активация синтеза гиалуроновой кислоты, фибронектина и тенасцина. Однако окончательно неизвестно, насколько данные молекулы влияют на функциональную активность миогенных клеток и их участие в репаративных процессах. В заключительной фазе (ремоделировании) миосимпласты распределяются, дифференцируются в мышечные трубочки и волокна, приводя к восполнению дефекта и восстановлению целостности мышечного волокна [21]. Базальная мембрана скелетной мышечной ткани преимущественно состоит из коллагенов IV, VI типов и лами-нина [22]. При дегенерации мышц остатки поврежденной базальной мембраны служат в качестве подложки, направляя слияние миофибрилл. Восстановление базальной мембраны обеспечивается клетками новообразованной мышцы [23]. Учитывая основную функцию базальной мембраны (поддержание структуры ткани), основные ее компоненты, являются предметом для изучения во многих исследованиях, посвященных восстановлению скелетной мышечной ткани [24]. Несмотря на то, что ремоделирование ВКМ признается ключевым условием нормальной регенерации, до конца не изучено, как меняется состав переходного матрикса во время восстановления мышечной ткани и какие сигналы подают компоненты ВКМ миогенным клеткам-предшественницам [25]. Основной фибриллярный белок ВКМ - коллаген, функция которого состоит в обеспечении прочности и упругости тканей. Синтез различных типов коллагена и его накопление в тканях в основном связано с активностью фибробластов [20]. Коллаген обладает способностью регулировать клеточную адгезию, хемотаксис и миграцию [26]. В настоящее время выделяют 27 типов коллагенов, самыми распространенными из которых являются I, II, III и IV типы [27]. Ключевая роль коллагена в поддержании тканевого гомеостаза обуславливает его применение при создании ТИК. Показано, что коллаген, используемый как субстрат в исследованиях in vitro, поддерживает жизнеспособность и приводит к увеличению пролиферативной активности миогенных прогениторных клеток [28]. В серии работ на модели объемных дефектов мышечной ткани проводили трансплантацию ТИК на основе коллагеновых губок, витализированных миобластами. При этом отмечали минимальный воспалительный ответ и стимуляцию образования мышечной ткани в области повреждения не только за счет донорских клеток, но и за счет клеток реципиента [29]. В модели миодистрофии Дюшенна доказано повышение эффективности миогенных клеток, выражавшееся в активации синтеза дистрофина, при их трансплантации в составе ТИК, содержащего коллаген, по сравнению с инъекцией суспензии клеток [30]. Другой фибриллярный компонент ВКМ эластин - это нерастворимый белковый полимер, синтезирующийся из тропоэластина, линейного полипептида с молекулярной массой 60-70 кДа. В работах G. Ciofani с соавт. (2013) и Р. D'Andrea с соавт. (2015) было обнаружено, что использование эластина и эластиноподобных полимеров в качестве подложки для культивирования мио-бластов стимулировало их пролиферацию и дифферен-цировку, активацию синтеза тяжелых цепей миозина, а также слияние клеток и формирование многоядерных миотуб, и степень стимуляции пролиферации и диффе-ренцировки миобластов зависела от типа используемого эластиноподобного пептида[31, 32]. Фибронектин также является фибриллярным белком, который представлен в организме человека тремя изоформами: - растворимой формой в кровеносном русле; - олигомерами фибронектина на клеточной поверхности; - нерастворимыми волокнами фибронектина в составе ВКМ. Фибронектин - это димер, состоящий из двух мономеров, связанных парой дисульфидных связей, он присутствует в различных типах тканей и играет существенную роль в формировании ВКМ, адгезии клеток и выполнении ими определенных функций [20]. В эмбриогенезе фибронектин участвует в прикреплении и миграции клеток. Исследователями установлена способность фибро-нектина регулировать баланс между самообновлением и дифференцировкой сателлитных клеток за счет связывания сигнальных молекул Notch и Wnt. При первичном повреждении мышечной ткани секретируемый фибро-бластами фибронектин формирует фибриллярную структуру «суперфибронектина», которая приводит к активному хемотаксису клеток воспаления (макрофагов) [33]. Еще один фибриллярный белок ВКМ ламинин - высокомолекулярный гетеротример, состоящий из a-, ß-и у-цепей, каждая из которых кодируется отдельными генами [34]. Известно о существовании 1 6 функционально различных изоформ ламинина, одна из которых (LM-2/11) является наиболее распространенной изоформой, содержащейся в мышечных тканях. Рядом авторов описана роль ламинина в миогенезе и связь некоторых заболеваний мышечной ткани с нарушением его синтеза. Так, исследования, направленные на установление этиологических факторов врожденных мышечных дистрофий, показали, что мутации гена LAMA2, локализованного в области хромосомы 6q22-23, Гены & Клетки Том XIII, № 4, 2018 ОБЗОРЫ 19 приводят к этим заболеваниям [34, 35]. В настоящее время известно о существовании более 80 мутаций гена LAMA2 и различных клинических форм аллельных вариантов мерозин-негативной врожденной мышечной дистрофии. Установлено, что ген LAMA2 кодирует а2-цепь белка ламинина, который является одним из ключевых компонентов базальной мембраны поперечнополосатых мышц, а также присутствует в периферических нервах и ЦНС. В соответствии с современными научными данными, основная роль этого белка заключается в сцеплении миофибрилл мышечных волокон с коллагеновыми структурами межклеточного пространства [35, 36]. Основу структуры ВКМ составляют протеогликаны, состоящие из белковой части и ковалентно связанных с ней полисахаридов (гликозаминогликанов), таких как хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератансуль-фат или гиалуроновая кислота [6]. Роль протеогликанов в миогенезе описана в ряде современных работ [2, 37]. Установлено, что при заболеваниях, связанных с поражением скелетных мышц, наблюдается увеличение синтеза протеогликанов на фоне регенерации мышечной ткани [37]. Аналогичные результаты были получены при изучении регенеративных процессов в скелетных мышцах после их механического повреждения [38]. Имеются данные о том, что миогенез в ходе эмбрионального развития и при регенерации поврежденной мышцы сопровождается изменением спектра протеогликанов [38, 39]. Протеогликаны, входящие в состав ВКМ, оказывают не только регуляторное влияние на взаимодействие ми-областов с ВКМ, но и регулируют действие факторов роста (bFGF, HGF и TGFb), контролирующих пролиферацию и дифференцировку данных клеток [3, 39]. Протеогликаны могут взаимодействовать с другими молекулами ВКМ, а также с факторами роста, ци-токинами и хемокинами, участвуя в разных процессах жизнедеятельности клеток и, тем самым, способствуя сборке матрикса [6]. Установлено, что фибромодулин, принадлежащий к семейству протеогликанов, активно синтезируется во время миогенеза. Увеличение его концентрации во время мышечных повреждений имеет значение для компенсации ингибиторного эффекта миостатина и для регуляции экспрессии миогенных регуляторных факторов, контролирующих пролиферацию. Кроме того, фибромодулин усиливает миграцию сател-литных клеток, ускоряя тем самым восстановление поврежденных волокон. Известно, что взаимодействие ми-областов с фибромодулином определяет их дальнейшую судьбу, обеспечивая выполнение программы миогенной дифференцировки [40]. Гиалуроновая кислота - один из основных компонентов ВКМ с высокой биологической активностью, она способна усиливать ангиогенез и предотвращать апоптоз. В исследовании С.А. Rossi с соавт. (2011) в модели мышечной атрофии изучались эффекты трансплантации сателлитных клеток и миобластов, помещенных в гидрогель на основе гиалуроновой кислоты [41]. Функциональное восстановление мышечной ткани, подтвержденное измерением сократительной силы, было связано авторами в первую очередь с формированием новой сосудистой сети и восстановлением иннервации [41]. В другой работе было обнаружено, что гиалуро-новая кислота обеспечивает необходимое внеклеточное микроокружение для возникновения и (или) поддержания пластины роста конечностей и суставов во время эмбрионального развития и регенерации мышечной ткани у взрослых [25]. Помимо этого, известно, что гиалуроно-вая кислота влияет на миграцию миобластов из поврежденной базальной мембраны в бластему in vivo, а также может препятствовать их преждевременному слиянию и дифференцировке [25]. Другие гликозаминогликаны, помимо гиалуроновой кислоты, являющиеся не формирующими волокна белками ВКМ, также оказывают регуляторное воздействие на процессы регенерации, например, посредством связывания bFGF и других факторов роста [3, 42]. Необходимость взаимодействия различных компонентов ВКМ в процессах миогенеза подтверждена в работе S.B. Ronning с соавт. (2013) [43]. Авторы показали, что гликозаминогликаны и фибриллярные белки ВКМ влияют на миогенную дифференцировку бычьих проге-ниторных клеток только совместно. Участие белков внеклеточного матрикса в миоген-ной дифференцировке. По данным современной литературы известно, что взаимодействие прогениторных клеток с матриксом обеспечивает поддержание их в недифференцированном состоянии. Например, мультипо-тентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), культивируемые на компонентах ВКМ различного происхождения, дольше сохраняют пролиферативный и диф-ференцировочный потенциалы, чем при культивировании на пластике, и не подвергаются при этом спонтанной дифференцировке [44, 45]. В то же время при индукции дифференцировки ММСК in vitro в любом направлении наблюдаются строго специфичные изменения в составе и структуре их ВКМ [46]. Взаимодействие клеток с компонентами ВКМ происходит главным образом через интегрины, связывание которых с RGD-последовательностью в составе матрикс-ных белков запускает сигнальные пути, регулирующие выживание, миграцию, пролиферацию и дифференци-ровку [47]. Показано, что нарушение взаимодействия ММСК с коллагеном I типа, опосредованного интегрина-ми a2ß1 и а11 ß1, ведет к гибели клеток [48]. В регуляции участвуют и другие механизмы взаимодействия клеток с матриксом. В частности, гликозаминогликаны ВКМ связывают факторы роста, оказывающие воздействие на клетки с миогенным потенциалом [3, 42]. В ряде исследований установлено, что на дифферен-цировку прогениторных клеток в миогенном направлении влияют белки, относящиеся к семейству матриксных металлопротеиназ (ММР). Семейство ММР - это группа родственных по структуре цинк-зависимых эндопептидаз, участвующих в деградации базальной мембраны. Эти белки экспрессируются во всех тканях и на всех стадиях онтогенеза. Они секретируются в неактивной форме в межклеточное пространство, где активируются под действием других протеаз и функционируют в условиях тканевой перестройки. ММР участвуют в механизмах ангиогенеза и апоптоза. ММР единственные про-теолитические ферменты, способные денатуририровать фибриллярные коллагены. Коллагенолитическая активность матриксных протеиназ впервые была обнаружена в 1962 г. [49]. На сегодняшний день в семейство ММР входит 28 ферментов. ММР имеют нумерацию и в зависимости от структур и (или) субстратной специфичности выделяют 5 подсемейств: коллагеназы (ММР-1, ММР-8 и ММР-13), стромелизины (MMP-3 и ММР-10), матрилизины (MMP-7 и ММР-26), мембранный тип ММР (МТ-ММР, ММР-1 и ММР-8) и желатиназы (ММР-2 и ММР-9). Все матриксные металлопротеиназы обладают некоторыми сходными свойствами: они имеют общие участки аминокислотной последовательности, синтезируются в виде неактивных проферментов и нуждаются в цинке в качестве кофактора [50]. W. Wang с соавт. (2009) доказали, что матриксная металлопротеиназа-1 (MMP-1) может стимулировать Гены & Клетки Том XIII, № 4, 2018 20 ОБЗОРЫ восстановление мышечной ткани путем активации диф-ференцировки и миграции миобластов [51]. Кроме того, в модели миодистрофии у мышей было установлено, что одновременное внутримышечное введение ММР-1 и миобластов значительно повышает эффективность регенерации. Этот же белок в экспериментах in vitro на культуре ММСК костного мозга человека Z. Zheng с соавт. (2012) использовали для дифференцировки клеток в миоген-ном направлении и показали, что количество мРНК и уровень выработки белков MyoD и десмина прямо пропорционально увеличиваются при добавлении ММР-1 [52]. MMP-1 принимает участие в деградации коллагенов I, II и III типов, расщепляет нематриксные компоненты и активирует факторы роста, киназы, цитокины, хемоки-ны, рецепторы мембран и протеогликаны. MMP-1 способствует дифференцировке ММСК костного мозга в мышечные клетки in vitro за счет модификации ВКМ, в том числе его нематриксных компонентов, что приводит к изменению прочности ВКМ и активации сигнальных путей [53]. В то же время группа ученых под руководством S.M. Hindi (2013) обнаружила эффект ММР-9, отличный от эффекта MMP-1: ингибирование ММР-9 увеличивало количество сателлитных клеток в скелетных мышцах mdx-мышей, запускало альтернативную активацию макрофагов (М2-фенотипа) и стимулировало Notch и классический Wnt сигнальные пути [54]. Достоверно известно, что Notch-сигнальный путь вовлечен в процесс активации миогенной дифференцировки мышечных про-гениторных клеток во время эмбриогенеза и постнаталь-ного миогенеза. Кроме того, этот сигнальный путь необходим для поддержания дифференцировки сателлитных клеток при регенерации мышц. Также было выявлено, что ингибирование ММР-9 значительно улучшает приживление донорских миобластов в мышцах mdx-мышей. Таким образом, был сделан вывод о том, что блокирование активности ММР-9 - один из наиболее значимых факторов в улучшении регенерации мышечных волокон при клеточной терапии [55]. Важной составляющей ВКМ являются матрилины, представляющие собой мультидоменные внеклеточные белки-адаптеры. Основная их функция в ВКМ - организация нитевидной околоклеточной сети, связанной с коллагеновыми фибриллами и протеогликанами. Матрилины представляют семейство олигомерных внеклеточных переходных белков, наибольшее содержание которых характерно для хрящевой ткани, однако они также присутствуют и в ВКМ других тканей. Матрилины связываются с различными типами коллагеновых фибрилл, с другими нековалентными белками и с аггреканом. Таким образом они поддерживают матричную сборку, соединяя фибриллярные компоненты, а также за счет взаимодействия с аггреканами. Связывающая авид-ность матрилина варьируется путем альтернативного сплайсинга, протеолитической обработки и образования гомо- и гетероолигомеров. Такие изменения в структуре матрилина могут приводить к модуляции сборки ВКМ. Некоторые матрилины слабо связываются с a1ß1-интегрином и протеогликанами клеточной поверхности, но, хотя матрилины играют определенную роль в меха-нотрансдукции, а матрилин-3 активирует экспрессию генов, связанных с развитием остеоартрита, в настоящее время физиологическая значимость взаимодействия матрилин-клетка не ясна. В экспериментах было показано, что у мышей, нокаутных по одному или нескольким генам матрилина, не проявляются выраженные изменения фенотипа. Этот факт указывает на наличие схожих изоформ внутри семейства матрилинов или других функционально родственных белков. Например, у человека мутации в участке гена матрилина-3, кодирующем домен, подобный фактору фон Виллебранда А, приводят к удержанию белка в эндоплазматическом ретикулуме, что вызывает множественную эпифизарную дисплазию, инициируя клеточный стресс-ответ. Напротив, мутация в EGF-домене матририна-3, связанная с развитием остеоартрита и дегенерацией диска, не мешает выходу белка из клетки и, более того, стимулирует внеклеточную сборку матричных структур [56]. Одним из наиболее распространенных белков данной группы в ВКМ является матрилин 2 типа (Mtn-2), который в различных количествах содержится практически в любой ткани организма. Повышение его экспрессии наблюдается во время миогенной дифференцировки клеток в условиях in vitro и во время регенерации скелетных мышц in vivo до тех пор, пока не начнется процесс созревания миоволокон [57]. В работе É. Korpos с соавт. (2015) было показано, что Mtn-2 играет ключевую роль в своевременном запуске программы регулирования ми-огенеза [58]. Mtn-2 выделяется миобластами и способен напрямую или косвенно (посредством взаимодействия с белками ВКМ) связываться с интегринами и(или) другими поверхностными рецепторами клеток для регулирования сигнальных путей, в частности пути TGF-ß/BMP-7/ Smad. Внеклеточный сигнал, вызываемый Mtn-2, является решающим в индуцированииТН3и последующего Trf3/Taf3-зависимого переключения на заключительный этап мышечной дифференцировки. TGF-ß1 ингибирует миогенную дифференцировку по крайней мере за счет частичного подавления экспрессии Mtn-2, следовательно ставит под угрозу Trf3-зависимую переходную регуляционную программу. В отсутствии Mtn-2 Trf3 не индуцируется, и хотя сигналы других белков ВКМ могут активировать MyoD и миогенный каскад на более низком уровне, это происходит с некоторым отставанием по сравнению с индукцией Trf3 и приводит к задержке миогенеза [58]. Тканеинженерные внеклеточные матриксы. Известно, что ВКМ может оказывать влияние не только на дифференцировку стволовых клеток in vivo, но и поддерживать их в недифференцированном состоянии, создавая микроокружение - «ниши», в которых находятся стволовые клетки [59]. После многолетних исследований роли ВКМ в регенерации поврежденных органов и тканей был сделан вывод о том, что взаимодействие ВКМ и клеток необходимо для усиления их пролиферактивной активности, дифференцировки, адгезии, миграции и приживаемости in vivo [60]. В связи с этим начали активно применяться методики тканевой инженерии - междисциплинарной области, совмещающей инженерный и биологический подходы, к воспроизводству ex vivo функциональных живых тканей, используя стволовые клетки, факторы роста и подходящие природные и(или) синтетические биоматериалы, имитирующие естественный ВКМ. Используемые биоматериалы должны воспроизводить биологические и механические свойства естественного клеточного микроокружения и создавать временную 3D-структуру, в которой клетки могут адгезировать, пролиферировать, дифференцироваться и организовываться в пространстве, тем самым формируя новую ткань [59]. Подход тканевой инженерии для восстановления дефектов скелетных мышц основан на двух классических стратегиях: in vitro и in vivo [61]. In vitro стратегия направлена на создание зрелых и функциональных структур искусственных мышц путем культивирования клеток с миогенным потенциалом на биомиметическом каркасе, Гены & Клетки Том XIII, № 4, 2018 ОБЗОРЫ 21 пока не будет получена мышечная ткань с правильной структурой, пригодная для трансплантации. In vivo стратегия заключается в трансплантации клеток отдельно или совместно с биоматериалом (каркасом, матриксом-носителем) для воспроизведения локальной ниши в месте повреждения, чтобы влиять на регенерацию и реконструкцию мышц. Более инновационная и перспективная стратегия развития тканевой инженерии скелетных мышц - это подход in situ, при котором регенерация поврежденной ткани происходит за счет резидентных про-гениторных клеток, а стимулирующее влияние оказывают используемые биоматериалы В целом, эти три стратегии, хотя и отличаются преимуществами и ограничениями, связаны необходимостью подбора новых биосовмести-мых матриксов, которые, как и ВКМ, должны поддерживать 3D-структуру, воспроизводить механические и физико-химические функции, содействующие процессам дифференцировки миогенных клеток, защищать их от повреждений, вызванных иммунным ответом и, наконец, стимулировать васкуляризацию и иннервацию [62]. Исходно трехмерные мышечные органоиды были получены на основе коллагеновых матриксов, которые даже удалось параллельно ориентировать с использованием статического растягивания [62]. В последнее время все более популярным и перспективным инструментом в тканевой инженерии становится нативный децеллюляризированный ВКМ, содержащий матричный белок и факторы роста, необходимые для регенерации тканей [63]. Такой ВКМ можно получить из тканей млекопитающих, удалив клетки и ДНК с помощью ферментов, физико-химических агентов, моющих средств или их комбинации. Однако воздействие этих средств может изменить биохимические, механические и структурные свойства ВКМ, поэтому важно оптимизировать и стандартизировать протоколы децеллюля-ризации ВКМ [64]. Децеллюляризированный ВКМ рассматривается как идеальный кандидат для применения в качестве матрицы (матрикса-носителя) с целью восстановления мышечной ткани, поскольку не только стимулируется образование новой мышечной ткани за счет активации резидентных клеток и обеспечения миграции миогенных клеток, но и происходит его иннервация в ре-ципиентном ложе. Ряд децеллюляризированных ВКМ, полученных из подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи, дермы человека, быка и свиньи, мочевого пузыря свиньи, различных видов перикарда и сердечных клапанов свиней, уже одобрены FDA [65]. Мышечные трансплантаты на основе децеллюляризированного ВКМ показали обнадеживающие результаты в восстановлении дефектов мышечной ткани [63]. В работе B.M. Sicari с соавт. (2014) были протестированы мышечные импланты на основе ВКМ на пациентах с мышечным дефицитом, и в 60 % случаев были установлены функциональные улучшения [66]. В то же время было отмечено, что имплантация матриксов, содержащих в своем составе ВКМ, может вызывать иммунный ответ. Однако инфильтрация матрикса мононуклеарными клетками реципиента, приводящая к его деградации, оказывает положительное влияние на регенерацию тканей, поскольку вызывает выброс множества биологически активных молекул, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и инсулиноподобный фактор роста (IGF), которые хемотаксически мобилизуют к месту имплантации матрикса различные типы клеток, в том числе способных к миогенезу [66]. Было показано, что эти факторы способствуют переключению макрофагов из провоспалительного фенотипа М1 в секреторный М2. Последнее в сочетании с секретируемыми факторами активирует миосателлитоциты и другие про-гениторные клетки, которые стимулируют образование новых тканей, васкуляризацию и иннервацию [67]. В работе H. Yi с соавт. (2017) был продемонстрирован новый подход для усиления пролиферации и диф-ференцировки мышечных прогениторных клеток [68]. Он основан на одновременном использовании ВКМ скелетных мышц и модифицированного альгинатного гидрогеля, конъюгированного с желатином и гепарином в качестве субстрата. Такое сочетание субстрата с ВКМ скелетных мышц значительно увеличивало пролиферацию клеток, дифференцировку и созревание мышечных прогениторных клеток по сравнению с отдельно взятыми субстратами. Иммуноцитохимическим методом и вестерн-блот анализом было выявлено увеличение экспрессии маркеров скелетного миогенеза (фактора миогенной дифференцировки 1 (MyoD), миогенного фактора 5 (Myf5), миогенина, десмина и миозина) и образование мышечных трубочек [68]. X. Zhang с соавт. (2017) разработали систему культивирования для результативной дифференцировки в миогенном направлении прогениторных мышечных клеток [69]. На первом этапе был подобран метод де-целлюляризации тканей печени, почек и скелетных мышц свиньи для получения ВКМ. Далее бесклеточные матриксы гомогенизировали и растворяли в гидрогеле на основе гиалуроной кислоты с добавлением гепарина. Пролиферацию и дифференцировку прогениторных мышечных клеток человека оценивали при культивировании в 3 вариантах: на геле, децеллюляризованном ВКМ и на комбинированном субстрате ВКМ-гель-гепарин. Пролиферация клеток оказалась наивысшей в образцах, содержащих в качестве субстрата ВКМ-гель-гепарин. Также в этих образцах отмечали значительно большее количество дифференцированных мышечных трубочек и специфичных маркеров миогенных клеток (миозин, десмин, MyoD и Myf5). На основании полученных данных авторы выдвинули предположение, что такой субстрат обеспечивает наиболее оптимальное микроокружение клеток и является приближенным к условиям in vivo [69]. Естественные молекулы, используемые в тканевой инженерии для формирования ВКМ, не животного происхождения - хитозан (ракообразные), фиброин шелка (тутовый шелкопряд), альгинат и агароза (морские водоросли) - широко применяются в тканевой инженерии скелетных мышц, поскольку проявляют эндогенные биоактивные свойства и могут создавать комплексы с углеводами, образуя молекулы, способные связываться с факторами роста [6]. Например, альгинат с жесткостью между 13 и 45 кПа улучшает пролиферацию и дифференцировку миобластов, а также усиливает выработку различных факторов роста (VEGF и HGF), важных для регенерации скелетных мышц [70]. Еще один тип материалов, пригодных для воссоздания ВКМ, представлен большой группой синтетических матриксов. Преимущество синтетических материалов по сравнению с естественными - возможность с большой точностью адаптировать механические и структурные свойства получаемого продукта под индивидуальные требования. Сополимер молочной и гликолевой кислот (полилактид-ко-гликолид (ПЛГ)) одобрен FDA и еще 30 лет назад использовался как шовный материал в медицине. Биоразлагаемый ПЛГ также является подходящим материалом для матриксов, он обеспечивает клеточную адгезию, пролиферацию и образование новых трехмерных тканей. Было показано, что пористые матриксы на основе ПЛГ стимулируют васкуляризацию Гены & Клетки Том XIII, № 4, 2018 22 ОБЗОРЫ и клеточную инфильтрацию при имплантации in vivo. Эти результаты доказывают, что ПЛГ вполне подходит для тканевой инженерии [71]. Y. Shandalov с соавт. (2014) описал протокол получения тонкого васкуляризованного лоскута ткани для реконструкции полнослойного дефекта брюшной стенки у мышей [70]. Матрикс создавали путем смешивания поли^-молочной кислоты и ПЛГ. На поверхность лиофилизированных матриксов высевали эндотелиальные клетки, миобласты и фибробласты в матригеле в соотношении 1:1 и культивировали в течение 10 сут. in vitro, чтобы клетки смогли самоорганизоваться. Полученная ТИК была обернута и подшита вокруг бедренной артерии и вены на 7 сут. для васкуляризации. Затем васкуляризованный графт вместе с питающими его сосудами был пересажен в область полнослойного дефекта брюшной стенки. В результате была отмечена хорошая интеграция графта в окружающую его интакт-ную мышечную ткань, а также его устойчивость к механической нагрузке. Преимущества использования описанного материала заключаются в том, что матриксу можно придать любую конфигурацию и геометрию (сетка, гидрогель, пена, пленка), а за счет химических модификаций можно создавать матриксы с заданными биологическими свойствами [70]. Использование композиций из разных материалов для создания ТИК также представляет интерес. В результате комбинации полиэтилегликоля с фибриногеном (ПЭГ-фибриноген) был получен инновационный гидрогель: ПЭГ позволяет контролировать качество материала, а фибриноген обеспечивает специфическую биоактивность (в частности, клеточную адгезию). Такой гидрогель активно применяют для трехмерного культивирования клеточных культур, в клеточной терапии кардиологических заболеваний и тканевой инженерии [62]. Возможность локализованного и контролируемого перехода жидкость-твердое состояние (желирование) в присутствии клеточной суспензии, которое может происходить как in vitro, так и in vivo, например, внутри поврежденной мышцы, - одно из главных достоинств этого биоматериала. Так, была продемонстрирована способность ПЭГ-фибриногена в качестве носителя клеток направлять и усиливать терапевтический эффект при трансплантации донорских периваску-лярных миогенных предшественников (мезангиобла-стов) [59]. Более того, используя модифицированный ПЭГ-фибриноген для инкапсуляции мезангиобластов, удалось разработать «инъецируемую» мышцу [59]. В моделях как острого повреждения, так и хронической дистрофии скелетной мышечной ткани у мышей, было подтверждено, что инкапсулированные клетки эффективно дифференцировались в миогенном направлении и встраивались в область повреждения [59]. Заключение Детальное представление о составе и функциях компонентов ВКМ является необходимым условием для создания эффективных и безопасных материалов и продуктов для медицинского применения. Понимая химические основы взаимодействия органических структурных соединений ВКМ, их влияние на дифференцировку клеток, пространственную организацию ткани, возможно создать максимально приближенный к нативному матрикс, на котором будут расти клетки, формируя трехмерную структуру ткани полностью биосовместимую и безопасную. Представленный в обзоре анализ современных представлений о ВКМ мышечной ткани, его происхождении, составе, функционировании в норме и патологии, механизмах деградации и дисплазии, в том числе генетически обусловленной, позволит исследователям и разработчикам оптимизировать свои технологии и приблизиться к их клиническому применению.

About the authors

T. V Stupnikova

Institute of General Pathology and Pathophysiology

I. I Eremin

Institute of General Pathology and Pathophysiology; JSC «Generium»

V. L Zorin

Institute of General Pathology and Pathophysiology; PJSC “Human Stem Cells Institute"

P. B Kopnin

Institute of General Pathology and Pathophysiology; N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

I. R Gilmutdinova

Institute of General Pathology and Pathophysiology; National Medical Research Center for Rehabilitation and Balneology

I. N Saburina

Institute of General Pathology and Pathophysiology; Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

A. A Pulin

Institute of General Pathology and Pathophysiology; JSC «Generium»; Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: andreypulin@gmail.com

References

Supplementary files