Erythropoietin-mediated activation of functional properties of peripheral blood mononuclear cells in patients with chronic heart failure

Full Text

Введение Различные виды стволовых и прогениторных клеток используют для стимуляции репаративных процессов в зоне ишемии миокарда при инфаркте, поскольку результаты пилотных исследований выявили увеличение сократительной функции миокарда и уменьшение зоны рубца при их применении [1]. Источником гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) может служить периферическая кровь после их мобилизации из костного мозга гранулоцитарным-ко-лониестимулирующим фактором (Г-КСФ) [2]. Более того, в ходе мобилизации ГСК инъекциями Г-КСФ в периферической крови было отмечено увеличение количества эндотелиальных прогениторных клеток, а интрамиокардиальное введение обогащенной ГСК фракции мононуклеаров периферической крови (МНК) стимулировало сократительную функцию и улучшало перфузию ишемизированного миокарда у больных с хронической сердечной недостаточностью [3]. Для стволовых клеток в общем смысле характерной является способность к дифференциров-ке в специализированные клетки тканей организма, а также продукция цитокинов и факторов роста, обладающих в том числе ангиогенным действием [4]. Продуцируемые стволовыми клетками биологически активные вещества способствуют пролиферации, миграции, дифференцировке и поддержанию жизнеспособности трансплантированных клеток [4-6]. Эритропоэтин является не только стимулятором гемопоэза, но и оказывает проангиогенное действие, схожее с VEGF и FGF, а также обладает кардиопро-тективным эффектом [7-10]. Показано, что эндотелиальные клетки экспрессируют рецептор к эри-тропоэтину, а взаимодействие его с эритропоэтином способствует их пролиферации и неоваскуляризации [10]. Кроме того, эритропоэтин активирует пролиферацию, дифференцировку и адгезию клеток-пред-шественниц эндотелия сосудов, проявляет антиапоп-тотический эффект, однако механизмы действия эритропоэтина изучены не в полной мере. Цель работы - оценить влияние эритропоэти-на на функциональную активность МНК больных хронической сердечной недостаточностью (ХСН) до и после обогащения периферической крови путем мобилизации стволовых клеток Г-КСФ, а также определить эффективность обогащенных МНК в лечении пациентов с ХСН. Материал и методы Исследование проведено с участием 48 пациентов с ишемической болезнью сердца, III-IV функциональным классом ХСН (NYHA), после получения информированного согласия, согласно протоколам, одобренным Этическими комитетами и утвержденных учеными советами обоих учреждений-соиспол-нителей (протокол №5 от 02.06.2008 г. - Институт клинической и экспериментальной лимфологии; протокол № 26 от 24.02.2009 г. - Институт патологии кровообращения им. акад. Е.Н Мешалкина). Средний возраст пациентов составил 57,0±7,6 лет (89% мужчины), длительность заболевания ишемической болезнью сердца -7,94±5,86 лет, количество перенесенных инфарктов миокарда - 1,59±0,77. Сначала от каждого пациента забирали образцы крови для выделения необогащенных МНК. Затем выполняли мобилизацию стволовых и прогенитор-ных клеток в периферическую кровь путем введения пациентам рекомбинантного человеческого Г-КСФ (Grasalva, Израиль) подкожно в дозе 3,3-5,0 мкг/ кг веса в сутки в течение 5 сут. Для сбора МНК, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками, на 6 сут. проводили процедуру аппаратного ци-тофереза на сепараторе клеток крови (Haemonetics MCS+, США; программа PBSC - получение периферических стволовых клеток). МНК из венозной несепарированной крови больных ХСН до мобилизации и из сепарированной крови больных ХСН после мобилизации выделяли на градиенте плотности фиколла/верографина (р = 1,078 г/л) (Биолот, Россия) и дважды отмывали в забуференном физиологическом растворе. Далее подсчитывали количество жизнеспособных клеток в камере Горяева с витальным красителем трипановым синим и определяли фенотип эндотелиальных прогениторных клеток с помощью проточного цитометра FACSCantoII (Becton Dickinson, США) в программе FACSDiva (Becton Dickinson, США), с использованием моноклональных антител CD34, CD133, VEGFR2, CD31, меченных FITC и PE (Becton Dickinson, США), согласно инструкции фирмы-производителя. Для оценки пролиферативного потенциала МНК и влияния эритропоэтина на их функциональную активность клетки вносили в лунки 96-луночных планшетов в количестве 2х105 кл/лунка и культивировали в среде RPMI-1 640, дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина с 10% FCS, (БиолоТ, Россия) в Ш2-инкубаторе при 37°С в течение 72 ч. в присутствии эритропоэтина (33 Ед/мл; Рекормон, США) и без него (контроль). Уровень пролиферативной активности МНК определяли в МТТ-тесте в триплетах по включению клетками 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (Sigma, США) и преобразованию его в формазан митохондриальными дегидрогеназами. Оптическую плотность растворов формазана измеряли на спектрофотометре (STAT FAX 2100, США) при длине волны 540 нм и выражали в условных единицах оптической плотности (ед. опт. пл.). Уровень продукции цитокинов измеряли в кондиционированных средах от 72 ч. культур МНК, которые хранили при -20°С до тестирования. Содержание в кондиционированной среде TNF-a, IL-8, IL-10, IL-18, VEGF, эритропоэтина и Г-КСФ определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием специальных наборов реагентов (Вектор-Бест, Россия), согласно инструкции фирмы-производителя. Процедуру введения мобилизованных МНК периферической крови, оценку клинической эффективности проводили на базе Института патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина. Пациентам интрамиокардиально под контролем навигационной системы NOGA XP вводили МНК, выделенные на градиенте плотности фиколла/верографина из сепарированной крови, в количестве 3х108 клеток в 10 точек по 0,2 мл в каждую точку. Эффективность интрамиокардиального введения мобилизованных Г-КСФ МНК периферической крови оценивали через 6 и 1 2 мес. по изменению функционального класса сердечной недостаточности по NYHA, объему фракции выброса левого желудочка сердца (ФВЛЖ) с помощью ЭХО КГ и изменению перфузии миокарда по данным ЭКГ-синхронизированной томосцинтиграфии Гены & Клетки Том XII, № 2, 2017 84 оригинальные исследования (SPECT) с технецием (Tc-99m) в покое и при нагрузке, индуцированной введением аденозина. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistics 10,0 for Windows (StatSoft, США). Полученные данные проверяли на нормальность распределения согласно критерию Колмогорова-Смирнова. Меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Me), нижним (25% - LQ) и верхним (75% - HQ) квартилями. Достоверность различий оценивали по непараметрическому U-критерию Манна - Уитни. Наличие взаимосвязей между явлениями устанавливали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R). Различия считали достоверными при p<0,05. Результаты После выделения МНК был определен их пролиферативный потенциал; зависимость пролиферативного потенциала от количества CD34+-клеток; уровень продукции эритропоэтина до и после процедуры мобилизации Г-КСФ и влияние эритропоэтина на продукцию цитокинов. МНК, обогащенные стволовыми и прогениторны-ми клетками, имели статистически значимо более высокий исходный уровень пролиферативной активности (Me = 0,49; LQ = 0,42; UQ = 0,55 ед. опт. пл., рис. 1А), по сравнению с аналогичным показателем у МНК до процедуры мобилизации (Me = 0,37; LQ = 0,34; UQ = 0,43 ед. опт. пл.). Стимуляция эри-тропоэтином повышала уровень пролиферации обогащенных МНК (Me = 0,66; LQ = 0,57; UQ = 0,67 ед. опт. пл.), однако не влияла на уровень пролиферации МНК, выделенных из крови больных ХСН до процедуры мобилизации стволовых и прогениторных клеток (Me = 0,41; LQ = 0,37; UQ = 0,51 ед. опт. пл.). Установлено, что пролиферативный потенциал обогащенных МНК зависел от количества CD34+-клеток. Если количество CD34+-клеток во фракции МНК было больше 0,4%, базальная интенсивность пролиферации МНК статистически значимо возрастала на 60%, а после прекондиционирования с эритропоэтином - на 64% по сравнению с уровнем пролиферации МНК, содержащих менее 0,4% CD34+-клеток (рис. 1Б). При определении уровня эритропоэтина в кондиционированных средах МНК был обнаружен его резкий рост после мобилизации стволовых и проге-ниторных клеток Г-КСФ (p = 0,008) (табл. 1). Таким образом, обогащение периферической крови мобилизированными стволовыми и прогениторны-ми клетками у больных с ХСН приводило к увеличению общей пролиферативной активности МНК и росту продукции эритропоэтина. На следующем этапе работы было изучено влияние прекондиционирования МНК эритропоэтином на цитокин-продуцирующую активность клеток, выделенных из крови больных ХСН, до и после процедуры мобилизации стволовых и прогениторных клеток введением Г-КСФ. Прекондиционирование МНК эритропоэтином до проведения процедуры мобилизации приводило к увеличению продукции IL-10, IL-18 и IL-8 (табл. 2). А Б Рис. 1. Пролиферативная активность МНК пациентов с ХСН до и после проведения процедуры мобилизации Г-КСФ: А - влияние эритропоэтина на пролиферацию МНК; Б - пролиферация МНК в зависимости от количества CD34+-клеток Примечания: Спонт - спонтанный уровень пролиферации; ЭПО - уровень пролиферации в ответ на добавление эритропоэтина; * - различия при сравнении с показателями до введения Г-КСФ статистически значимы при <0,04; # - при p<0,05 Таблица 1. Концентрация эритропоэтина в кондиционированных средах МНК до и после процедуры мобилизации у пациентов с ХСН (n = 20). Данные представлены как Медиана, нижний-верхний квартили До мобилизации После мобилизации Концентрация (МЕ/мл) Концентрация (МЕ/мл) Эритропоэтин 27,2 (17,8-101) 102,2 (36-306) Гены & клетки Том XII, № 2, 2017 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 85 Таблица 2. Уровни продукции цитокинов и факторов роста МНК до и после мобилизации стволовых и прогениторных клеток, прекондиционированных эритропоэтином, у больных ХСН (n = 35) Цитокины, пг/мл До мобилизации После мобилизации уровень спонтанной секреции уровень секреции, стимулированной эритропоэтином уровень спонтанной секреции уровень секреции, стимулированной эритропоэтином TNF-a 102,3 (100-175) 100,2(99-101) 33,0(23-85) 990,3* (792-1298) IL-10 67,7 (57-101) 294,5*(189-300) 72,1(22-102) 895,4* (790-1190) IL-18 33,0(18-102) 399,4*(212-415) 103,2(67-135) 190,5* (104-228) IL-8 732,9(103-965) 3840,7* (2890-4160) 735,7(103-822) 1578,8* (348-3100) G-CSF 13,1(10-101) 8,5(7-10) 11,0(10-30) 865,5* (586-3660) VEGF 256,2(102-450) 253,4(219-270) 298,1(113-340) 327,0* (278-492) * - различия при сравнении с уровнем спонтанной секреции статистически значимы при p<0,05 (U-критерий Манна ■ Уитни). В то же время обогащенные МНК при кондиционировании с эритропоэтином увеличивали продукцию TNF-a, IL-10, IL-18, IL-8, Г-КСФ и VEGF, по сравнению с базальным уровнем. Следовательно, прекондиционирование МНК эри-тропоэтином способствовало увеличению продукции цитокинов и факторов роста, вовлеченных в регуляцию ангиогенеза. Кроме того, после прекондиционирования МНК эритропоэтином были выявлены корреляционные связи между базальной продукцией IL-18 и IL-10 (R = 0,65; р = 0,045). В то же время, исходный уровень продукции МНК IL-8 находился в обратной взаимосвязи с IL-18 (R = -0,76; р = 0,01). Таким образом, показана способность эритропоэ-тина оказывать регулирующее влияние на продукцию ряда биологически активных веществ МНК, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками. Известно, что функциональная активность эндотелиальных прогениторных клеток связана с их фенотипом [11]. Ранее нами было показано, что в ходе мобилизации стволовых и прогениторных клеток в периферическое русло введением Г-КСФ у больных с ХСН увеличивалось количество различных популяций эндотелиальных прогениторных клеток, находящихся на различных этапах дифференцировки [12]. Корреляционный анализ между фенотипом эндотелиальных прогениторных клеток и уровнями про дукции цитокинов и факторов роста выявил наличие сопряженности между секрецией МНК эритропоэтина и количеством в общем пуле МНК клеток с фенотипом CD34-/VEGFR2 + (R = 0,86; р = 0,005). Кроме того, имелась прямая корреляция между уровнем продукции TNF-a и количеством CD34-/CD133+ клеток (R = 0,73; р = 0,02); IL-18 и количеством CD34+/ VEGFR^-клеток и CD34+/VEGFR2+-клеток (R = 0,70; р = 0,03 и R = 0,82; р = 0,01 соответственно). Уровень продукции МНК VEGF имел прямую корреляционную связь с количеством CD34+/CD31+-клеток (R = 0,90; р = 0,03), а IL-10 - с количеством клеток с фенотипом CD34-/CD31+ в общем пуле МНК у больных с ХСН (R = 0,95; р = 0,03). Выявленные корреляционные связи позволяют предположить, что циркулирующие эндотелиальные прогениторные клетки с фенотипом CD34-/VEGFR2+ вносят вклад в продукцию эритропоэтина у больных с ХСН. На последнем этапе исследования был проведен анализ корреляции между уровнями продукции ци-токинов и факторов роста МНК больных ХСН, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками, с параметрами функциональной активности миокарда у больных в отдаленный период после интрами-окардиального введения этих клеток. Было обнаружено наличие взаимосвязей уровня продукции МНК эритропоэтина с классом сердечной недостаточности, перфузией миокарда и ФВЛЖ (табл. 3). Таблица 3. Корреляция уровня продукции эритропоэтина МНК, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками, с функциональными показателями миокарда в отдаленный период после интрамиокардиального введения клеток больным ХСН (n = 20) Исследуемые параметры уровень эритропоэтина Класс СН (NYHA) через 6 мес. R = 0,05 р = 0,9 через 12 мес. R = 0,47 р = 0,046 Перфузия в покое через 6 мес. R = 0,59 р = 0,049 через 12 мес. R = 0,19 р = 0,12 Перфузия при нагрузке через 6 мес. R = 0,28 р = 0,49 через 12 мес. R = 0,67 р = 0,03 ФВЛЖ через 6 мес. R = 0,75 р = 0,03 через 12 мес. R = 0,45 р = 0,25 Гены & Клетки Том XII, № 2, 2017 86 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Была выявлена положительная прямо пропорциональная связь между уровнем продукции эритропо-этина и улучшением класса сердечной недостаточности через 12 мес. и возрастанием ФВЛЖ через 6 мес. после интрамиокардиального введения МНК. Уровень продукции эритропоэтина был связан с показателями перфузии миокарда, причем наблюдались корреляционные связи между уровнем продукции цитокина и улучшением перфузии в покое через 6 мес., а также увеличением перфузии при нагрузке аденозином через 12 мес. наблюдения. На основании полученных результатов можно предположить, что вводимые интрамиокардиально МНК, обогащенные стволовыми и прогениторными клетками, оказывали положительное влияние на функцию ишемизированного миокарда у больных с ХСН. Обсуждение В настоящее время считается, что основным механизмом действия трансплантированных стволовых и прогениторных клеток является паракринный. Биологически активные молекулы (цитокины и факторы роста) продуцируются клетками как конститутивно, так и при активации внешними стимулами и являются регуляторами межклеточных взаимодействий, определяют выживаемость, рост, дифференцировку и функциональную активность клеток [6]. Известно, что эритропоэтин способен не только стимулировать клетки эритропоэза, но и обладает цитопротективным действием на другие виды клеток, экспрессирующих его рецептор [13, 14]. Так эритропоэтин способствует эндотелиальной диф-ференцировке клеток, повышает экспрессию факторов дифференцировки стволовых клеток, увеличивает секрецию ими проангиогенных цитокинов [15, 16], подавляет апоптоз и повышает выживаемость [17]. Показано, что дополнительное введение эритропоэтина при трансплантации мобилизованных Г-КСФ клеток крови уменьшало сердечную недостаточность при инфаркте миокарда [18, 19], а совместное введение эндотелиальных прогениторных клеток с эритропоэтином в экспериментальной модели церебральной ишемии активировало процессы не только ангиогенеза, но и нейрогенеза [20]. Также кратковременное культивирование эндотелиальных колониеобразующих клеток с эритропоэтином значительно стимулировало их пролиферацию, миграцию, образование первичной тубулярной сосудистой сети и приводило к увеличению плотности капилля ров при экспериментальной ишемии нижних конечностей [21]. Таким образом, эритропоэтин может не только стимулировать продукцию Г-КСФ, а значит увеличивать мобилизацию стволовых и прогениторных клеток из костного мозга в кровоток, но и способствовать стимуляции ангиогенеза и модулировать функциональную активность трансплантированных клеток. В нашем исследовании обнаружено, что эритропоэтин стимулировал функциональный статус МНК, выделенных из крови после мобилизации Г-КСФ у пациентов с ХСН: увеличивались пролиферативная активность МНК и уровень продукции цитокинов и факторов роста с ангиогенным действием. Установлено, что уровень секреции эритропоэтина имел корреляционную связь с численностью популяции эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD34-/VEGFR2+, популяции эндотелиальных клеток. В то же время, активированная продукция TNF-a, IL-18, VEGF, и IL-10 была взаимосвязана с другими популяциями клеток эндотелиальной линии разной степени дифференцировки. Очевидно, что продуцируемые мобилизованными клетками цитокины влияют друг на друга, образуют «цитокиновую сеть», а в их продукции принимают участие различные популяции эндотелиальных клеток [5]. Спектры биологической активности цитокинов в значительной степени перекрываются, стимулируя процессы репарации более чем одним цитокином. Следовательно, можно предположить, что паракринные и аутокрин-ные взаимодействия могут иметь место в тканях при введении обогащенных стволовыми и прогениторны-ми клетками МНК. В настоящем исследовании показана прямая корреляция между секреторным уровнем эритро-поэтина трансплантированных клеток и перфузией миокарда, а также классом сердечной недостаточности через 6 и 12 мес. наблюдения у пациентов с ХСН, что может свидетельствовать о вкладе эри-тропоэтина и эндотелиальных клеток в процессы репарации миокарда. Таким образом, эритропоэтин может являться пусковым фактором в регенерации поврежденного миокарда как прямо, так и опосредованно путем индукции синтеза клетками других цитокинов, в том числе с ангиогенным действием.

About the authors

O. V Poveshchenko

Scientific Institute of Clinical and Experimental Lymphology; Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

Email: poveschenkoov@yandex.ru

N. A Bondarenko

Scientific Institute of Clinical and Experimental Lymphology; Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

I. I Kim

Scientific Institute of Clinical and Experimental Lymphology; Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

A. P Lykov

Scientific Institute of Clinical and Experimental Lymphology; Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

M. A Surovtseva

Scientific Institute of Clinical and Experimental Lymphology; Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

E. A Pokushalov

Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

A. B Romanov

Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

A. F Poveshchenko

Scientific Institute of Clinical and Experimental Lymphology; Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

V. I Konenkov

Scientific Institute of Clinical and Experimental Lymphology; Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

A. M Karaskov

Novosibirsk Scientific Institute of Circulating Pathology

References

Supplementary files