Genome editing on cell model of the genetic form of Parkinson's disease

Full Text

Введение Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным заболеванием, обусловленным гибелью дофаминергических нейронов среднего мозга и падением уровня нейротрансмиттера дофамина в стриатуме, что приводит к мышечной ригидности, гипокинезии, тремору, постуральной неустойчивости и другим неврологическим проявлениям [1]. В механизмах развития БП важная роль принадлежит «генетике». На сегодняшний день известны 20 самостоятельных локусов БП, что свидетельствует о ее выраженной гетерогенности и потенциально большом числе молекулярных путей, ведущих к патологии нигростриатной системы [2, 3]. Один из наиболее часто вовлекаемых генов - PARK2 - расположен на хромосоме 6q25.2-27 и связан с развитием аутосомно-рецессивной БП с ранним проявлением симптомов [4]. Благодаря последним открытиям в области молекулярной и клеточной биологии в настоящее время активно развиваются высокотехнологичные подходы для исследования «моделей заболевания в пробирке» [5]. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из зрелых соматических клеток, представляют собой уникальную платформу для моделирования нейродегенеративных заболеваний, изучения их тонких патофизиологических основ и оценки действия лекарственных препаратов [6-9]. Такие модели на основе ИПКС позволяют преодолевать трудности в изучении нейродегенеративной патологии, связанные с ограниченным доступом к человеческим нервным клеткам [10]. Нами была создана клеточная модель генетической БП в результате репрограммирования фибробластов кожи пациента с мутациями в гене PARK2 [8]. Полученные ИПСК были успешно дифференцированы в дофаминергические нейроны [11, 12]. Показано, что уровень проапоптотического белка Bak в клетках с мутацией PARK2 практически в два раза ниже по сравнению со здоровыми клетками, тогда как экспрессия антиапоптотических факторов Bcl-XL, Bcl-W и Bcl-2 была достоверно увеличена в мутантных клетках по сравнению со здоровыми до-фаминергическими нейронами [13]. Эти данные позволили предположить, что мутации в гене PARK2 сопровождаются сложной разбалансировкой систем Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 115 программируемой клеточной гибели, в рамках которой ведущая роль принадлежит неапоптозным молекулярным механизмам. Установлена также функциональная несостоятельность дофаминового транспортера в мутантных дофаминергических нейронах, несмотря на повышенную экспрессию данного белка в культуре [14]. Таким образом, созданная клеточная модель позволила раскрыть ряд важных молекулярных механизмов PARK2-формы БП. Полученные в результате репрограммирования PARK2-дофаминергические нейроны были трансплантированы в стриатум крыс с токсической экспериментальной моделью паркинсонизма, индуцированного введением 6-гидроксидофамина в черную субстанцию [11]. Отмеченный при этом у животных терапевтический эффект сопровождался отчетливой дофаминергической реиннервацией стриатума, подтвержденной иммуноцитохимическими методами [11, 15]. Полученные результаты продемонстрировали, что нейроны с мутациями в гене PARK2 сохраняют определенную функциональную активность in vivo на протяжении длительного времени после нейротрансплантации, однако к 120 сут. наблюдения эта активность начинает постепенно снижаться [15]. Очевидно, что общий репаративный потенциал мутантных нейронов ограничен, поэтому для успешной реализации данного терапевтического подхода в клинике требуется коррекция нарушенной нуклеотидной последовательности гена. Такая коррекция может быть осуществлена с помощью новейших технологий направленного геномного редактирования, основанных на использовании искусственных программируемых нуклеазных систем [16, 17]. Для прицельной генетической модификации сайтов-мишеней применяют искусственные нуклеазные системы на основе белков с «цинк-пальцевыми» доменами (ZNF) [18], аналогов транскрипционных активаторов (TALEN) [19] и бактериальных CRISP-локусов, ассоциированных с ферментом Cas9 и использующих короткие РНК при распознавании мишени (CRISPR/Cas9) [20]. Система CRISPR/Cas9 за последние годы благодаря своей простоте и эффективности уже нашла применение в самых различных областях фундаментальной и прикладной биологии, биотехнологии и медицины. С помощью системы CRISPR/Cas9 можно осуществлять все виды модификаций генома: вносить точковые мутации, встраивать в определенные места новые гены либо, наоборот, удалять крупные участки нуклеотидных последовательностей, исправлять или заменять отдельные генетические элементы и фрагменты генов [17, 21-23]. В нашей работе мы впервые предприняли попытку коррекции мутаций в гене PARK2 в уже упомянутой выше культуре ИПСК, полученной из фибробластов пациента с аутосомно-рецессивной формой БП. Развитие данного подхода позволит значительно расширить возможности персонифицированной медицины и неврологии и улучшить результаты проводимого лечения у конкретного пациента. Материал и методы В работе были использованы культуры клеток здорового донора и пациента с аутосомно-рецес-сивной ювенильной формой БП, являющегося носителем компаунд-гетерозиготных мутаций в гене PARK2 (del202-203AG и IVS1+1G/A). Из биоптатов кожи обоих исследуемых лиц нами ранее получены фибробласты, которые были репрограммированы при помощи оригинальных лентивирусных векторов с факторами плюрипотентности (LeGO-hOCT4, LeGO-hSOX2-IRES-GFP, LeGO-hc-Myc, LeGO-hKLF4) с целью получения клонов ИПСК [8]. В результате репрограммирования были получены клеточная линия Tr5, несущая мутации в гене PARK2, и клеточная линия от здорового пациента без мутаций. Анализ нуклеотидных последовательностей в «областях интереса» в гене PARK2, а также последовательностей спейсоров РНК-гидов проводили на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems, США). Ниже представлена структура праймеров, задействованных в работе: • PARK2_1F: 5'-GTGAGGAGAAACTACGCGTTAGAA-3 ' ; • PA RK2_1 R: 5'-GTCATTGACAGTTGGCACCG-3'; • Park 2.2 forw_long: 5'-GGAAATCTCGTGGGTAACTAACTCTG-3'; • Park2.2rev_long:5'-ATTCACTAAGCCTAGCTCGTGTG-3'. Для выбора двухцепочечных спейсоров при работе с системой CRISPR/Cas9 применяли следующие биоинформатические ресурсы и программы: www.gemome-engineering.org,www.dna20.com/ ecommerse/cas9/input и www.e-crisp.org. В нашей работе мы использовали плазмиды pgRNA и pCaG_Cas9_GFP (Addgene IDs #44251, #44719, США). Подобранные с помощью биоинформационных программ гиды клонировали в вектор рgRNA рестрикцией по сайтам Nde I и Xba I. Сайты рестрикции вносились в ПЦР-продукты благодаря дизайну соответствующих праймеров: FORW Nde I (5'-AATGGACTA TCATATGCTTACCGTAACTTG-3') и REV Xba I (5'-AACTTT GTACAAGAAAGCT GGGTCTAGAA-3'). Для ПЦР-амплификации спейсоров РНК-гидов применяли различные пары праймеров, нуклеотидные последовательности которых приведены в табл. Таблица. Праймеры, использованные для амлификации спейсоров РНК-гидов Последовательность спейсоров Праймер прямой Праймер обратный РНК-гид № 2: AGTGACCATGATAGATACGTGG AGTGACCATGATAGATACGGTTTTAGAGC CGTATCTATCATGGTCACTCCGGTG для коррекции № 14: TAGGTACGTGGGTACCTGCCAGG TAGGTACGTGGGTACCTGCCGTTTTAGAGCT GGCAGGTACCCACGTACCTACCGGTG мутации в интроне РНК-гид № 6: GTGTCAGAATCGACCTCCACTGG GTGTCAGAATCGACCTCCACGTTTTAGAGC GTGGAGGTCGATTCTGACACCCGGTG для коррекции № 15: CAGCATCTTCCAGCTCAAGGAGG CAGCATCTTCCAGCTCAAGGGTTTTAGAG CCTTGAGCTGGAAGATGCTGCCGGTG мутации в экзоне № 16: GGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGG GGAGGTGGTTGCTAAGCGACGTTTTAGAGC GTCGCTTAGCAACCACCTCCCCGGTG Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 116 оригинальные исследования Первоначально с внешним праймером FORW Nde I и внутренними праймерами REV амплифицировали продукт длиной 104 п.о., а с помощью внутренних праймеров FORW и внешнего праймера REV Xba I - продукт длиной 129 п.о. ПЦР-продукты наносили на 2% агарозный гель и после разделения фрагменты элюировали из геля с применением набора Isolate II PCR and gel kit (Bioline, Великобритания). В следующем раунде амплификации с праймерами FORW Nde I и REV Xba I в качестве матрицы брали элюированные фрагменты. Полученный ПЦР-продукт для каждого гида секвенировали, а затем лигировали с помощью набора NEBuilder HiFi dNA Assembly Master Mix (BioLabs, Великобритания) в плазмиду рgRNA, предварительно рестрицированную по сайтам Nde I и Xba I. Клетки E. coli трансформировали 10 мкл ли-газной смеси согласно стандартному протоколу. Для дальнейшего анализа выросшие колонии (по десять для каждого двухцепочечного спейсора) проверяли на наличие и размер вставок при помощи ПЦР без выделения плазмидной ДНК с праймеров, указанных в табл. Продукты ПЦР-амплификации анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Из проанализированных таким образом клонов (n = 50) 32 колонии содержали вставку необходимой длины (200 п.н.). Отобранные клоны для гидов № 2, 6, 14, 15 и 16 (табл.) нарастили и выделили из них плазмиды в препаративных количествах. Для доставки в ИПСК генетических конструкций (плазмиды, одноцепочечные донорные молекулы ДНК) применяли метод липофильной трансфекции с Turbofect (Fermentas, США). В качестве донорных молекул были использованы нижеследующие олигонуклеотиды длиной 120 п.о. (Евроген, Россия): • WT-INTRON: CCGCTGCGCG CATGGGCCTG TTCCTGGCCC GCAGCCGCCA CCTACCCAGTGA CCATGATAGGTA CGTGGGTACCTG CCAGGTACAG CCTCTCTGCG CCGCCCCAC GCCCCGGTA TGGCGC; • WT-Exon: CCCAGTGGAG GTCGATTCTG ACACCAGCAT CTTCCAGCTC AAGGAGGTGG TTGCTAAGCG ACAGGGGGTT CCGGCTGACC AGTTGCGTGT GATTTTCGCA GGGAAGGAGC TGAGGAATGA. Через 48 ч. в ИПСК здорового пациента, трансфицированных плазмидой pCAG_Cas9_GFP, подсчитывали эффективность трансфекции по количеству GFP-позитивных клеток методом проточной цитометрии на приборе Bd FACSCalibur (Bd Biosciences, США), а также по проценту клеток, экспрессирующих белок GFP, с применением конфокального микроскопа (Zeiss Axio Imager, Германия). Через 72 ч. после проведенной трансфекции для коррекции мутаций клетки снимали диспазой (Gibco, США), промывали раствором PBS, после чего выделяли геномную ДНК набором Wizard genomic dNA purification kit (Promega, США). Участки гена PARK2, которые служили мишенями для редактирования генома, амплифицировали с применением высокоточной полимеразы Pfu dNA polymerase (Fermentas, США) и соответствующих пар праймеров. Результаты и обсуждение Для оценки эффективности доставки генетических конструкций ИПСК, полученные от здорового пациента, трансфицировали плазмидой pCAG_ Cas9_GFP. Эффективность трансфекции оценивали посредством конфокальной микроскопии по экс прессии зеленого флюоресцентного белка - GFP (рис. 1), кодируемого генетической конструкцией в одной рамке считывания с геном нуклеазы Cas9 через линкерную последовательность T2A, а также с помощью метода проточной цитометрии. Эффективность трансфекции составила 10%. Рис. 1. Трансфекция ИПСК здорового донора плазмидой pCas9_GFP ИПСК линии Tr5, полученные из фибробластов пациента с болезнью Паркинсона, ассоциированного с мутациями в гене PARK2, трансфицировали плазмидами pCas9, различными вариантами плазмиды pgRNA и одноцепочечными олигонуклеотидами для коррекции мутации в экзоне, интроне, в экзоне и ин-троне одновременно. После выделения ДНК из клеток были проведены ПЦР-амплификации участков-мишеней (экзон 2, интрон 1) и их прямое секвенирование. Секвенирова-ние второго экзона гена (рис. 2) PARK2 показало, что введение AG в положении 202-203 с восстановлением нормального генотипа было достигнуто при использовании гидов № 6, 15 и одноцепочечного зонда, выступающего в качестве донорного фрагмента «дикого» типа для гомологичного участка экзона. В то же время коррекция мутации с помощью гидов № 8 и 16 оказалась не эффективной. Редактирование однонуклеотидной замены IVS1+1G/A в 1-м интроне гена PARK2 с помощью системы CRISPR/Cas9 осуществляли при использовании гидов № 2, 14 и одноцепочечного зонда, выступающего в качестве донорного фрагмента «дикого» типа для гомологичного участка интрона, а также в эксперименте по одновременной коррекции мутаций в интроне и экзоне с применением гидов № 2 и 16, соответственно. Сопоставление соотношения пиков, соответствующих аденину и гуанину в положении однонуклеотидной замены в 1-м интроне гена PARK2, в клеточных линиях Tr5 до и после трансфекции показывает, что замена G>A с нормализацией нуклеотидной последовательности частично произошла (четкое увеличение пика G на рис. 3Б и 3В относительно Гены & клетки Том XI, № 2, 2016 оригинальные исследования 117 рис. 3А); при этом эффективность геномного редактирования в случае применения РНК-гида № 14 (рис. 3В) была заметно более высокой по сравнению с гидом № 2 (рис. 3Б). Нарастание пика G, соответствующего нормальному сиквенсу, объясняется увеличением числа матриц, несущих нативную нуклеотидную последовательность, относительно матриц, несущих мутацию. Одновременная коррекция мутации в экзоне и интроне гена PARK2 с помощью системы CRiSPR/ Cas9 оказалась не эффективной. Вероятно, это связано с низкой эффективностью одновременной А .-.GGIGGIIGCIÜGCGAC.-.GGGGGIICCG-GCIGiCC.--GTIGCGIGIGiTIIICGC.~.GGG.-.-GG.-.GCIG.-.GG-,T .-.GGTGGTT-GCTAAGCG.-.C.-.GGGGGTTCCG&CTG.-.CC.-.GTTGCGTGTGATTTTCSC.'.GGG^.-.GG.-.GCTG.'.GGA AGGIGGTTSCTA.-.GCG.--C---GGGGGTTCCGGCIG---CC>-GTTGC3TGTG;.TrTTC6C.--G<H:-.-.AGG--.CCTG---G3--. ÈIMÆUbMU Рис. 2. Коррекция мутации в экзоне 2 гена PARK2 с помощью системы CRISPR/Cas9: А - клеточная линия Тг5, исходная нуклеотидная последовательность с делецией del202-203AG (обведенная область); Б - клеточная линия Тг5 после редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 и РНК-гидов № 8 и 16 (сохраняется мутантная последовательность с делецией del202-203AG); В - клеточная линия Тг5 после редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 и РНК-гидов № 6 и 15 (восстановление нормальной нуклеотидной последовательности); Г - электрофореграмма сиквенса экзона 2 клеточной линии, полученной из фибробластов здорового донора (нормальная нуклеотидная последовательность). Фигурной скобкой на А и Б показана область со сдвигом рамки и наложением пиков, на В - та же область с восстановлением рамки доставки в нужных соотношениях молекул нуклеаз Cas9, РНК-гидов и донорных одноцепочечных фрагментов в ядро клетки при формировании комплексов ДНК-турбофект. Для повышения эффективности доставки генетических конструкций в ИПСК могут использоваться различные подходы - липо-фильная трансфекция, нуклеофекция, современные методы сортировки клеток и т.д. В дальнейшей работе мы планируем применять GFP-сортинг для получения обогащенной клеточной популяции, в которой система CRISPR/Cas9 работает наиболее эффективно. А CCGCCACCTACCCAGTGACCATGATAGATACGTGGGTACCTGCCAGGTA CCGCCACCTACCCA6TGACCATGATAGATACGTGGGIACCTGCCAGGTA CCGCCACCTACCCAGTGACCAIGATAGATACGTGGGTACCTGCCAGGTA CCGCCACCTACCCAGTGACCATGATAGGTACG-GGGTACCTGCCAGGTA Рис. 3. Коррекция мутации в 1-м интроне гена PARK2 с помощью системы CRISPR/Cas9: А - клеточная линия Тг5, исходная нуклеотидная последовательность с точковой мутацией IVS1+1G/A; Б - клеточная линия Тг5 после редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 и РНК-гида № 2 (по сравнению с рис. ЗА - нарастание пика G относительно пика А (стрелка)); В - клеточная линия Тг5 после редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 и РНК-гида № 14 (значительное нарастание пика G относительно пика А (стрелка)); Г - электрофореграмма сиквенса интрона 1 клеточной линии, полученной из фибробластов здорового донора (нормальная нуклеотидная последовательность). гены & клетки Том XI, № 2, 2016 118 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таким образом, нами проведено успешное редактирование генома ИПСК, полученных из фибробластов пациента - носителя компаунд-гетерозиготных мутаций в гене PARK2. С помощью системы CRISPR/ Cas9 удалось восстановить нормальную нуклеотидную последовательность в обеих аллелях данного гена, обусловливающего развитие аутосомно-рецес-сивной формы БП с ранним проявлением симптомов. На следующем этапе исследований будет осуществлена дифференцировка «нормализованных» ИПСК в дофаминергические нейроны, с детальным сопоставлением морфофункциональных свойств культур нейронов, имеющих мутантный и нормальный генотипы. Такие сопоставления позволят уточнить тонкие молекулярные механизмы PARK2-формы первичного паркинсонизма. Возможность направленной коррекции генотипа и получения дофаминергических нейронов, не несущих мутации, имеет большое значение для успешного развития нейротрансплантации при БП и других нейродегенеративных заболеваниях. Благодарности

About the authors

A. S Vetchinova

Research Center of Neurology

Moscow, Russia

E. V Konovalova

Research Center of Neurology

Moscow, Russia

P. Yu Volchkov

Moscow Institute of Physics and Technology

Dolgoprudny, Russia

N. Yu Abramycheva

Research Center of Neurology

Moscow, Russia

S. N Illarioshkin

Research Center of Neurology

Email: snillario@gmail.com
Moscow, Russia

References

Supplementary files